ICS65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 31791—2015 棉花曲叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Cotton leaf curl virus 2015-07-03发布 2015-11-27实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T31791—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共 和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国深圳 出入境检验检疫局、中华人民共和国茂名出入境检验检疫局 本标准主要起草人：张立、张永江、冯黎霞、李曼、张祥林、周雪平、郑耘、马洁、李海林、辛言言、 朱水芳、李明福。 I GB/T 31791—2015 棉花曲叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了棉花曲叶病毒的免疫学及分子生物学检疫鉴定等方法。 本标准适用于可能携带棉花曲叶病毒的植物组织的检疫鉴定。 2 仪器设备、用具和试剂 2.1 仪器设备 电子分析天平（0.001g）、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪、实时荧 光PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、4℃冰箱、超净工作台、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、 制冰机、涡旋振荡器、微波炉等。 2.2用具 可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL）、吸头、离心管、Eppendorf管（0.2mL、 0.5mL、1.5mL)和研钵等。 2.3试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂 DAS-ELISA、常规PCR及实时荧光PCR检测试剂分别见附录B、附录C及附录D。 3 检疫鉴定方法 3.1 DAS-ELISA 检测 DAS-ELISA检测见附录B。 3.2 常规PCR检测 常规 PCR检测见附录 C。 3.3 实时荧光PCR检测 实时荧光PCR检测见附录D。 4结果判断 3.1,3.2及3.3中两种不同原理的检测方法的结果为阳性，即可判定样品为CLCuV阳性。一般是 阳性。 1 GB/T31791—2015 5 样品保存与记录结果 5.1 样品保存 结果判定为阳性的样品应妥善保存，并做好登记和标记，以备复核用。保存期满后，需经灭活处理。 5.2 结果记录 完整的实验记录要包括：样品的来源、种类、时间、实验检测时间、地点、方法和结果，并有实验人员 的签字；DAS-ELISA检测需有酶联反应原始数据，PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光PCR检测需 有扩增曲线结果图片。 N GB/T 31791—2015 附录A （资料性附录） 棉花曲叶病毒背景资料 A.1背景资料 A.1.1 棉花曲叶病毒基本信息 中文名：棉花曲叶病毒。 学名：Cotton leaf curl virus。 缩写:CLCuV。 分类地位：双生病毒科（Geminiuiridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomouirus）。 传播途径：烟粉虱（Bemisiatabaci）传播及苗木嫁接传播。 A.1.2 2方法原理 根据棉花曲叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS-ELISA） 检测；根据该病毒DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大小或扩 增曲线的变化进行结果判定。 A.2 寄主范围 该病毒可侵染的寄主有：棉花（Gossypiumhirsutum）、烟草（Nicotianatabacum）、秋葵（Hibiscus esculentus）、番茄（Lycopersiconesculentum）、扶桑（Hibiscusrosasinensis）、苟麻（Abutilon theophrasti）、芝麻（Sesamumindicum）、矮牵牛（Petuniahybrida）、曼陀罗（Datura stramonium）等。 A.3分布 该病毒现主要分布在巴基斯坦、印度、苏丹、埃及、尼日利亚、马拉维和南非。 A.4病害症状 棉花植株受侵染后，早期表现新叶卷曲、叶脉膨大，后期在叶背面的主脉上形成耳突，植株矮化，结 实率下降或不结实。 SAC A.5粒体形态 棉花曲叶病毒具有典型的双联体颗粒形态，大小为18nmX30nm～20nm×30nm。 基因组特征 A.6 该病毒的基因组含有2个大小相近的环状ssDNA组分，大小为2.5kb～3.0kb 3