ICS65.020.01 CCS B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3859—2021 果品中交链孢霉菌鉴定 技术规程 Technical code of practice for identification of Alternaria Neesinfruits 行业标准信息服务平台 2021-11-01实施 2021-05-07发布 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3859—2021 全国愉业食品标准 公共服务 典通 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化生作导则 起草 本文件由农业农村部种植业管理司提出。 本文件由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC510)归口。 本文件起草单位：北京农业质量标准与检测技术研究中心、中国科学院植物研究所。 本文件主要起草人：姜冬梅、李博强、冯晓元、王蒙、王刘庆、郭晓军、韩平。 行业标准信息服务平台 1 NY/T3859—2021 果品中交链孢霉菌鉴定技术规程 1范围 本文件规定了鲜食果品中交链孢霉菌（AlternariaNees）的鉴定方法，包括分子生物学法（第一法）和 形态学法（第二法）。 本文件适用于鲜食果品中交链孢霉菌的鉴定 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性用而构成本文件必不可少的条款 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本义件 所有的修改单）适用于本 文件。 形态学鉴定 GB 4789. 16 食品安全 Q 金室用水 GB/T6682 分 格 生物安 通用要 GB19489 验室质量 食品分子生物学检测 GB/T27403 制规范 S 3 术语和定义 L 下列术语和定 以适用于 本文件 R 3. 1 聚合酶链式反 温变 种用于放 增特定的DNA片段的分子 模板NA用 单链，适宜的 单链上相应 互补 反应条件下，根据 板序列设主的两条乳物分别点 配对结合，在 DNA聚合酶的作用 下，以四种脱氧核糖本 磷酸NTP 按碱见 半保留复制 广不断重 循环，使日 原理，合成一条新的 ENTEI 的DNA片段以几何 音数力 3. 2 GenBank数据库 美国国家生物技术 CBI）建立的DNA序 列数据库。 4 防污染措施 4.1 鉴定过程中防污染措施按GB19489.GI 4.2鉴定过程中的含菌废弃物需经121℃高压灭菌处理3 min后再充置。 第一法分子生物学法 5原理 采用聚合酶链式反应（PCR）扩增样品中真菌核糖体基因内转录间隔区（ITS)序列，并对PCR产物进 行序列测定，将测序结果与GenBank数据库中的相关序列进行比对，确定样品中是否存在交链孢霉菌。 6主要试剂 6.1DNA提取溶液（见附录A中的A.1)。 1 NY/T3859—2021 6.2三氯甲烷-异戊醇混合液（24：1)。 6.3Tris-EDTA缓冲液（见附录A中的A.2）。 6.4PCR缓冲液（见附录A中的A.3)。 6.5dNTPs:2.5 mmol/L 6.6上样缓冲液（见附录A中的A.4)。 6.7TAE缓冲液（见附录A中的A.5)。 6.8DNA分子量标准：可以清楚区分100bp~1000bp的DNA片段。 6.9TagDNA聚合酶。 6.10琼脂糖：电泳纯。 6.11液氮。 6.12无水乙醇。 注：除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯或生化试剂，水为GB/T6682规定的一级水。 7设备和材料 除分子生物学实验室常规灭菌及培养设备外，其他主要设备和材料如下： a）高速冷冻离心机：最大转速≥10000r/min； b) 冰箱：-20℃,2℃~4℃; 天平：感量0.01g； 灭菌锅：最大压力为0.235MPa，可调控范围温度为105℃~135℃； e 旋涡混匀器：最大转速为2800r/min； PCR扩增仪：温度范围4℃~99℃，控温精度0.25℃； 电泳仪：输出电压5V~600V，输出电流2mA~200mA； h) 凝胶成像仪：302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光片、机载头像捕捉软 件、图像分析软件； 不锈钢小刀或眼科手术小刀； 微量可调移液器：2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1mL; k）离心管：0.2mL（PCR管）、1.5mL、2ml 8鉴定步骤 8.1样品采集与处理 用不锈钢小刀或眼科手术小刀切取果品病症组织约0.3g，用无菌滤纸吸干水分，加液氮研磨，至 粉末状。 8.2基因组DNA的提取 8.2.1将研磨后的样品转人2mL离心管，加入65℃预热的DNA提取溶液900μL,充分混匀，65℃保 温40min~60min，12000r/min离心10min 8.2.2取上清液转人新的1.5mL离心管中，加人等体积的三氯甲烷异戊醇混合液抽提10min，12000 r/min离心10min，重复一次。 8.2.3取上清液转入新的1.5mL离心管中，加人2倍体积的无水乙醇混匀，一20℃下放置不少于1h； 4℃.12000r/min离心10min。 8.2.4弃上清液，冷70%乙醇洗涤DNA沉淀2次。 8.2.5自然干燥后溶于50uL无菌水或Tris-EDTA缓冲液，制得模板DNA，一20℃冰箱保存备用。 注：基因组DNA也可使用商品化的DNA提取试剂盒提取，具体操作参照试剂盒说明。 8.3PCR反应