ICS67.100.99 CCSX16 团体标准 T/CITS0012—2023 牛乳基婴幼儿配方乳粉及牛乳中A1和A2 β-酪蛋白的测定液相色谱-串联质谱法 DeterminationofAlandA2β-caseininbovineinfantformulaandmilk LC-MS/MSmethod 2023-07-06发布 2023-08-01实施 中国检验检测学会发布 全国团体标准信息平台 T/CITS0012—2022 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规 则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国检验检测学会提出并归口。 本文件起草单位：雀巢食品安全研究院、中国海关科学技术研究中心、青岛海关技术中 心、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心。 本文件主要起草人：鲍蕾、冯鑫、张鸿伟、吕佳、汪龙飞、张晓梅、王金花、韩深、古 淑青、梁成珠。 全国团体标准信息平台 T/CITS0012—2022 牛乳基婴幼儿配方乳粉及牛乳中A1和A2β-酪蛋白的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本规程规定了牛乳基婴幼儿配方乳粉和牛乳中A1β-酪蛋白(Alβ-Casein)、A2β-酪蛋白 (A2-βCasin)的测定方法。 本规程适用于牛乳基的婴幼儿配方乳粉和液态乳中A1β-酪蛋白、A2β-酪蛋白含量的测 定。不适用于发酵乳制品和含水解或酶解酪蛋白产品。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适 用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文本。 3.1A1β-酪蛋白 是β-酪蛋白的一种变异体，其一级氨基酸序列中第67号位氨基酸为组氨酸。 3.2A2β-酪蛋白 是β-酪蛋白的一种变异体，其一级氨基酸序列中第67号位氨基酸为脯氨酸。 4方法原理 试样中的牛β-酪蛋白经尿素提取，二硫苏糖醇还原，碘乙酰胺烷基化，经胰蛋白酶酶解 为肽段，经液相色谱-三重四级杆质谱测定，同位素内标法定量。 5试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 5.1试剂 5.1.1碳酸氢钠(NaHCO3)。 5.1.2碳酸氢铵(NH4HCO3)。 5.1.3二硫苏糖醇(C4H10O2S2，DTT)。 5.1.4碘代乙酰胺(ICH2CONH2，IAA)。 全国团体标准信息平台 T/CITS0012—2022 5.1.5尿素。 5.1.6乙酸(CH3COOH)。 5.1.7甲酸(HCOOH):色谱纯。 5.1.8乙腈(CH3CN):色谱纯。 5.1.9碱性胰蛋白酶:活力大于10000BAEE每毫克蛋白质。 5.1.10牛β-酪蛋白标准品：纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质。须依照附录A方 法对牛β-酪蛋白标准品中A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白含量进行测定。 5.1.11牛A1β-酪蛋白特异肽标准品(序列: IHPFAQTQSLVYPFPGPIHNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSK)，纯度不低于90%。 5.1.12牛A1β-酪蛋白同位素标记特异肽标准品(序列: IHPFAQTQS(L*)VYPFPGPIHNS(L*)PQNIPP(L*)TQTPVVVPPF(L*)QPEVMGVSK)，纯度不 低于90%。 5.1.13牛A2β-酪蛋白特异肽标准品（序列: IHPFAQTQSLVYPFPGPIPNSLPQNIPPLTQTPVVVPPFLQPEVMGVSK)，纯度不低于90%。 5.1.14牛A2β-酪蛋白同位素标记特异肽标准品(序列: IHPFAQTQS(L*)VYPFPGPIPNS(L*)PQNIPP(L*)TQTPVVVPPF(L*)QPEVMGVSK)，纯度不 低于90%。 注：L*为同位素标记的亮氨酸(Leu-OH-13C6,15N7)。 5.2试剂配制 5.2.1碳酸氢钠溶液(100mmol/L)：称取4.20g碳酸氢钠，用水溶解后定容至500mL。 5.2.2碳酸氢铵溶液(50mmol/L)：称取3.95g碳酸氢铵，用水溶解后定容至1L。 5.2.3碳酸氢铵溶液(500mmol/L)：称取39.5g碳酸氢铵，用水溶解后定容至1L。 5.2.4二硫苏糖醇溶液(500mmol/L)：称取0.771g二硫苏糖醇，用50mmol/l的碳酸氢铵溶液 溶解后定容至10mL。(烷基化实验时使用) 5.2.5碘代乙酰胺溶液(500mmol/L)：称取0.925g碘代乙酰胺，用500mmol/L的碳酸氢铵溶 液溶解后定容至10mL。(烷基化实验时使用) 5.2.6乙酸溶液(1%，V/V)：移取0.1mL乙酸，用水稀释并定容至10mL。 5.2.7碱性胰蛋白酶溶液(1mg/mL)：称取10mg碱性胰蛋白酶，用1%乙酸溶液溶解后定容 至10mL。 5.2.8甲酸水溶液(0.1%，V/V)：吸取1mL甲酸，用水稀释并定容至1000mL。 5.2.9甲酸乙腈溶液(0.1%，V/V)：吸取1mL甲酸，用乙腈稀释并定容至1000mL。 5.2.10尿素(6mol/L)：称取180g尿素，加水溶解定容至500mL。 5.3标准溶液配制 5.3.1牛β-酪蛋白储备液(2mg/mL)：准确称取牛β-酪蛋白标准品20mg(精确至0.01mg)牛 A1β-酪蛋白特异肽标准品，用水溶解后定容至10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20℃冰 箱内，可保存使用6个月。分装保存，避免反复冻融。 5.3.2牛A1β-酪蛋白特异肽标准储备溶液(500μg/mL)：准确称取5.00mg(精确至0.01mg)牛 A1β-酪蛋白特异肽标准品，用水溶解后定容至10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20℃冰 箱内，可保存使用6个月。分装保存，避免反复冻融。本储备液用于色谱及质谱条件建立。 5.3.3牛A1β-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液(500μg/mL)：准确称取5.00mg(精确至 0.01mg)A1β-酪蛋白同位素标记特异肽标准品，用水溶解后定容至10mL。将溶液转移到塑 料瓶中，于-20℃冰箱内，可保存使用6个月。分装保存，避免反复冻融。 全国团体标准信息平台 T/CITS0012—2022 5.3.4牛A2β-酪蛋白特异肽标准储备溶液(500μg/mL)：准确称取5.00mg(精确至0.01mg)牛 A2β-酪蛋白特异肽标准品，用水溶解后定容至10mL。将溶液转移到塑料瓶中，置于-20℃冰 箱内，可保存使用6个月。分装保存，避免反复冻融。本储备液用于色谱及质谱条件建立。 5.3.5牛A2β-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液(500μg/mL)：准确称取5.00mg(精确至 0.01mg)牛A2β-酪蛋白同位素标记特异肽标准品，用水溶解后定容至10mL。将溶液转移到 塑料瓶中，置于-20℃冰箱内，可保存6个月。分装保存，避免反复冻融。 5.3.6同位素标记特异肽混合中间溶液(50μg/mL)：准确吸取1mL的牛A1β-酪蛋白同位素标 记特异肽标准储备溶液，1mL的牛A2β-酪蛋白同位素标记特异肽标准储备溶液，用水稀释 并定容至10mL。置于-20℃冰箱内，可保存使用1个月。分装保存，避免反复冻融。 5.3.7标准工作液的配制：分别吸取0μL、10μL、25μL、50μL、250μL、500μL、1mLβ- 酪蛋白储备液，用水定容至1mL，配成浓度为0mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、 0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL的β-酪蛋白工作液，将β-酪蛋白标准工作液各浓度乘以附录 A中求得的A1β-酪蛋白及A2β-酪蛋白占比，得到两种β-酪蛋白的标准工作液浓度。临用前 配制。 6设备和材料 6.1高效液相色谱串联质谱仪：电喷雾离子源。 6.2天平:感量0.01g，0.01mg。 6.3涡旋混合器。 6.4超声波振荡器。 6.5恒温水浴摇床。 6.6微孔滤膜:0.22μm。 7分析步骤 7.1试样制备 7.1.1液态奶:称取1g(精确至0.01g)试样，用6mol/L尿素定容至25mL。 7.1.2乳粉:称取1g(精确至0.01g)试样，用6mol/L尿素定容至100mL，超声溶解。 7.2试样烷基化与酶解 吸取100μL试样溶液，加入50μL同位素标记特异肽混合中间溶液，780μL碳酸氢钠溶 液和10μL二硫苏糖醇溶液，涡旋混匀，70℃恒温反应30min。取出冷却至室温，加入30μL 碘代乙酰胺溶液，涡旋混匀，暗处静置30min后加入20μL碱性胰蛋白酶溶液，涡旋混匀， 于37±0.5℃恒温酶解6h后冷却至室温，取出加入10μL甲酸混匀，室温静置30min，过0.22 μm滤膜于进样瓶中，供高效液相色谱-串联质谱仪检测。 7.3标准样品烷基化与酶解 吸取5.3.7中各浓度标准工作液100μL。分别为加入50μL同位素标记特异肽混合中间 溶液，100μL的尿素溶液，680μL碳酸氢钠溶液和10μL二硫苏糖醇溶液,涡旋混匀，70℃恒 温反应30min。取出冷却至室温，加入30μL碘代乙酰胺溶液，涡旋混匀，暗处静置30min 后加入20μL碱性胰蛋白酶溶液，涡旋混匀，于37±0.5℃恒温酶解6h后冷却至室温，加入 10μL甲酸混匀，室温静置30min，过0.22μm滤膜于进样瓶中，供高效液相色谱-串联质谱 仪检测。 全国团体标准信息平台