ICS 65.020.30 CCS B 41 SC 中华人民共和国水产行业标准 SC/T 7215—2021 流行性造血器官坏死病诊断规程 Code of diagnosis for epizootic haematopoietic necrosis 行业标准信息服务平台 2021-11-09发布 2022-05-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 SC/T 7215—2021 言 公共服务 食典通 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出。 本文件由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本文件起草单位：全国水产技术推广总站、中国检验检疫科学研究院、北京市水产技术推广站， 本文件主要起草人：张曼、王姝、余卫忠、王娜、潘勇、景宏丽、徐立蒲、蔡晨旭。 行业标准信息服务平台 SC/T7215—2021 流行性造血器官坏死病诊断规程 1范围 本文件给出了流行性造血器官坏死病（epizootichaematopoieticnecrosis，EHN）诊断程序，试剂和材 料、仪器设备、临床症状、采样、病毒的分离和检测及综合判定的要求。 本文件适用于流行性造血器官坏死病的流行病学调查、诊断检疫和疫情监测。 2规范性引用文件 其中，注日期的引用文件， 其最新版本 仅该日期对应的版本适 包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 防法 境动勿检疫采样 GB/T 18088 SC/T 7103 水生 动物 地检疫采样技术规范 S 3 术语和定义 要界正育 本文件没有需 术语租 UR 4 缩略语 年细胞系 BF-2：蓝鳃太阳 CPE：细胞 CTAB:十六 上观化 atyhirim hylammonm n BOm dATP：三磷酸腺 osphate dCTP：三磷酸 胞嘧皖脱 dinetriphosphe dGTP：三磷酸 dNTP:脱氧核糖 ibonucle riphosphat dTTP：三磷酸胸腺嘧啶脱氧核 caeo oxythymnidinetriphosphaie) EB：溴化乙啶（ethidiumbromide） EDTA：乙二胺四乙酸（eth diaminete cetie ELISA：酶联免疫吸附试验（enyimne linked immunosorbent FHM：胖头肌肉细胞系（fatheadminnowcellline） GCO：草鱼性腺细胞系（Ctenopharyngodonidellusovarycellline) HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-（2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid] IgG：免疫球蛋白G（immunoglobulinG) MCP：主要衣壳蛋白（majorcapsidprotein） OD：光密度（opticaldensity） PBST：含有Tween-20的磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline） PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） Taq：水生嗜热菌（Thermusaquaticus）DNA聚合酶 TMB.3.3'5.5-四甲基联苯胺（33'5.5-Tetramethylbenzidine) SC/T7215—2021 5诊断程序 流行性造血器官坏死病的诊断程序包括5个阶段。其中，病毒分离培养阶段分为2个步骤，PCR检 测阶段分为3个步骤。诊断流程图如图1所示。 1采样（见9） 2.1样品处理 （见10.1.1） 病毒分离培养 （见10.1） 阳性 2.2 病毒接种 阳性3.1DNA提取 ELISA检测 与观察 （见10.3） （见10.2.1） （见10.1.2） 3.2PCR扩增 3 PCR检测 （见10.2） 阴性 （见10.2.2） 3.3 琼脂糖凝 胶电泳及测序 （见10.2.4） 5综合判定（见11） 图1诊断流程图 6试剂和材料 6.1水：符合GB/T6682中一级水的规格。 6.2流行性造血器官坏死病毒参考株：由动物防疫主管部门指定单位提供。 6.3流行性造血器官坏死病毒单克降抗体：由动物防疫主管部门指定单位提供。 6.4抗流行性造血器官坏死病毒血清：由动物防疫主管部门指定单位提供。 6.5酶标二抗IgG：按照说明书使用。 6.6细胞系：EPC、BF-2FHM或GCO。 6.7TaqDNA聚合酶：5U/uL，-20℃保存。 6.8dNTPs:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmoL/L,一20℃保存。 6.9MgClz:25mmoL/L，一20℃保存。 6.10引物：浓度为10μmoL/L。序列如下： 反向引物R：5'AAA-GAC-CCG-TTT-TGC-AGC-AAA-C3 扩增蛙病毒MCP编码基因（见附录A），预期长度为585bp。 6.11无水乙醇：分析纯，使用前一20℃预冷。 6. 12 2琼脂糖：电泳纯。 6.13封闭液：1%明胶。 6.14终止液：2moL/L的硫酸。 6. 15 PCR阳性对照：含有已知EHNV参考株的细胞悬液或已知感染EHNV的组织。 6.16 PCR阴性对照：不含EHNV病毒的正常细胞悬液或正常组织。 6. 17 细胞培养液：按照附录B中的B.1配制，也可使用商品化试剂。 2