SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4824—2017 牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增 检测方法 Detection method for Akabane virus of bovine and ovine by LAMP 行业标准信息服务平台 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T48242017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、华南农业大学。 本标准主要起草人：鱼海琼、蔡先全、程益、贾坤、赵吟、王莹、田纯见、陈芳、陈茹、林志雄。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4824—2017 牛羊赤羽病病毒环介导等温扩增 检测方法 1范围 本标准规定了牛、羊赤羽病病毒环介导等温扩增检测方法。 本标准适用于牛，羊赤羽病病毒核酸现场快速初筛检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088出入境动物检疫采样 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件 AKAV赤羽病病毒（Akabanevirus） LAMP环介导等温扩增（Loop-mediatedisothermalamplification） 4 赤羽病概况 赤羽病病毒为单股RNA病毒，属布尼病毒科布尼病毒属，由其引发的赤羽病概况参见附录A。 行业标准信息服务平台 5试剂 5.1 RNA抽提试剂盒。 5.2 Bst DNA 聚合酶。 5.3 Betaine甜菜碱。 5.4 0.01mol/LPBS缓冲液（见附录B)。 5.5 10×Thermopol缓冲液。 5.6 100 mmol/LMgSO 5.7 10 mmol/L dNTP。 5.8 5XAMVBuffer及AMVRTase 5.9 AKAV细胞培养物（灭活）。 5.10 内引物（FIP+BIP)。 5.11 外引物（F3+B3）。 5.12 RNasin。 1 SN/T4824—2017 6设备与材料 6.1冷冻离心机。 6.2恒温水浴箱。 6.3生物安全柜。 6.4移液器。 7原理 作用下，由4条引物识别靶序列上的6个特定区域（参见C.1），在63℃左右对核酸进行等温扩增。扩 增产物加入染料后阳性孔会出现肉眼可见的绿色 8操作步骤 8.1 引物序列 参见C.2。 8.2 2样品的采集与前处理 8.2.1总则 采样参照GB/T18088进行。采样过程中样品不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴手套， 在具备相应生物安全条件的区域内按照生物安全要求进行操作。 8.2.2死胎或组织样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中或超声裂解仪器中充分研磨裂解，再加5.0mL PBS混匀，然后将组织悬液转入无菌1.5mL离心管中，离心取上清，编号备用。 8.2.3血液 8.2.4存放与运送 采集或处理的样品在2℃～8℃条件下保存不超过24h；若需长期保存，须放置一70℃冰箱，但应 避免反复冻融。采集的样品密封后，冷链运送到实验室。 8.3扩增试剂准备与配制 8.3.1核酸提取 移取200uL正常细胞培养物作为阴性对照，移取等量DEPC水作为空白对照。将200uL处理好 心管中作为阳性对照，按照核酸提取试剂盒要求提取病毒RNA。 2