SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4465—2016 国境口岸土拉热弗朗西丝菌荧光 PCR 检测方法 Test of Francisella tularensis with real-time PCR at frontier port 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4465—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：吕沁风、吴忠华、郑伟、罗鹏、何蕾、徐琦、李莉、杨永耀、蔡玉峰、周健青、沈若川。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4465—2016 国境口岸土拉热弗朗西丝菌荧光 PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸土拉热弗朗西丝菌的荧光PCR检测方法。 本标准适用于国境口岸感染土拉热弗朗西丝菌的人或动物荧光PCR检测。 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid) dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction) SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecyl sulfate) Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[tris（hydroxymethyl)aminomethane-HCI 3对象 检测对象为国境口岸疑似被土拉热弗朗西丝菌感染的人或动物 4 生物安全要求 所有有关土拉热弗朗西丝菌的实验室操作应按照以下规定执行： 大量活菌操作或动物感染实验在生物安全三级（BSL-3或ABSL-3）实验室内进行； 土拉热弗朗西丝菌标本检测操作在生物安全二级（BSL-2)实验室内进行； 土拉热弗朗西丝菌相关的无感染性的材料操作在生物安全一级（BSL-1)实验室内进行； 信息服务平台 土拉热弗朗西丝菌感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。 5材料和设备 在实验过程中需要如下仪器设备： 荧光定量PCR仪； 台式高速离心机（≥10000g）； 旋涡混合器； 移液器：量程0.1μL~2.5μL，量程1μL~10μL，量程10μL~100μL，量程100μL~1000μL。 6试剂 在实验过程中需要以下试剂： 1 SN/T 4465—2016 荧光PCR通用试剂，见表1土拉热弗朗西丝菌反应体系； 蛋白酶K消化液：10mmol/LTris-HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA,150mmol/LNaCl, 0.5%SDS,100μg/mL~200μg/mL蛋白酶K； 红细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl.25mmol/LKCl,5mmol/LMgCl2pH7.5。 7操作步骤 7.1标本采集 7.1.1血液标本：抽取人或动物静脉血3mL～5mL，放入带盖的EDTA抗凝管中，并做好标记送检。 7.1.2痰液标本：取患者新鲜痰液3mL～5mL，采痰前先用3%H，O，漱1次和清水漱口3次，用力咳 出气管深处真正呼吸道分泌物，勿混入睡液和鼻咽分泌物，用痰杯收集并做好标记送检。 7.1.3动物组织标本：无菌操作解部取动物的肝、脾组织标本0.25g放入无菌容器中，并标记取样日期 及采样部位。 7.2标本的前处理 7.2.1血液标本：无需前处理，可直接用于DNA提取。 7.2.2痰液标本：需先用2倍于标本体积的1mol/LNaOH消化，混匀振荡5min~10min，静止消化 30min，期间振荡2次~3次，使痰液充分液化，吸取0.5mL混悬液备用。 7.2.3动物组织标本：取0.25g标本，加人0.5mL无菌生理盐水，匀浆，静置10min，取上清液备用。 7.3DNA模板制备 7.3.1取0.5mL全血标本加人1mL红细胞裂解液，12000g离心10min，弃去上清液后，加人 50μL~100μL蛋白K消化液，55℃消化1h~3h，95℃灭活10min，离心12000g30s取上清液 5μL作为荧光PCR检测模板。也可采用等效的市售DNA抽提试剂盒。 7.3.27.2.2和7.2.3处理的标本12000g10min离心沉淀后弃去上清液，加入50μL～100uL蛋白酶 K消化液，55℃消化1h～3h，95℃灭活10min，离心12000g30s取上清液5&L作为荧光PCR检 测模板。也可采用等效的市售DNA抽提试剂盒。 7.4荧光PCR检测 7.4.1荧光PCR反应的引物和探针 引物和探针位于土拉热弗朗西丝菌的FpA基因内，引物和探针如下： 上游引物：5-GCGCTTTGACTAACAAGGACA-3'； 下游引物：5’-CACCAGCACCTGATGGAGAG-3； Taqman 探针:5'-FAM-TGGCCAGTTCTATCTTGAGGACCCCAAGT-TAMRA-3’。 7.4.2反应体系 反应液组成见表1，也可采用市售等效的土拉热弗拉西丝菌荧光PCR试剂盒。 表1土拉热弗朗西丝菌荧光PCR反应体系 名称 体积 浓度 终浓度 模板/阴性对照/阳性对照 5 μL 上游引物 10 μmol/ L 1 μl. 0.4 μmol/L, 2