SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4291—2015 猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫法 检疫技术规范 Quarantine protocol for simian immunodeficiency virus with dot immunobinding assay 行业标准信息服务平台 2015-09-02发布 2016-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4291—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广西出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫 局、苏州西山生物技术有限公司。 本标准主要起草人：罗兆飞、温和心、陈立军、刘军义、盘宝进、罗广生、韦梅良、艾军、时长军、郭连香。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4291—2015 猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫法 检疫技术规范 1范围 本标准规定了实验猴猴免疫缺陷病毒（SIV）斑点酶免疫法实验室检测的操作程序和技术要求。 本标准适用于实验猴猴免疫缺陷病毒（SIV）的检测、 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 实验猴 labprimates 人工饲养，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、 检定及其他科学实验的非人灵长类动物，如食蟹猴、猕猴等。 3.2 斑点酶免疫法 enzyme-linked immunospot assay 将抗原吸附到硝酸纤维膜上，将吸附了待检血清的滤纸盖在抗原点上，样本中病毒抗体和膜上的抗 原发生特异结合，然后加入酶标二抗反应，最后加入底物显色，使特异的抗原-抗体-酶结合物点呈现肉 眼可见的红色斑点，以定性检测病毒抗体 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 SIV：猴免疫缺陷病毒（simianimmunodeficiencyvi 设备和材料 5.1 恒温培养箱或水浴箱：37.0℃。 5.2 跷跷板式摇床或酶标板摇床。 涡旋振荡器。 5.4 可调移液器及吸头。 电子分析天平：精度0.1mg。 5.6 载样条：宽0.5cm，长1cm的小滤纸条。 1 SN/T 4291—2015 5.7渗滤垫：大小为9cm×9cm的厚滤纸。 5.8尖头镊子。 5.9大小为9 cmX9 cm方形塑料平皿。 6试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸留水或去离子水。 注：不同试剂盒制造商的产品应严格按照其说明书要求操作，本标准以猴免疫缺陷病毒斑点酶联免疫检测试剂盒 (VRL)"盒中的试剂及配制为例。 6.1预点SIV抗原的硝酸纤维抗原膜。 6.20.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液母液（10XPBS)：称取80gNaCl,29gNazHPO·12H,O,2g KCl,1.9gKH,PO4，加水至1L，充分溶解。 6.3磷酸盐缓冲液（1X×PBS）：取100mL10×PBS加900mL水，混匀。 6.4样本稀释液：称取5g脱脂奶粉，加PBS至100mL。 6.5洗涤液（0.1%PBST）：往1L1XPBS中加1mL吐温-20，混匀。 6.60.2mol/LpH8.0Tris缓冲液：称取11.34gTris粉末，加水至400mL。 6.7显色剂A：称取15mg4-氯-2-甲基重氮苯1,5-萘二磺酸盐（耐晒红TR盐），加Tris缓冲液至 5mL，充分溶解，即用即配。 6.8显色剂B：称取2mg茶酚，加水至5mL。 6.9酶标二抗：取10μL碱性磷酸酶标记的羊抗猴IgG抗体加入10mLPBS中作1：1000稀释作为 工作液。 6.10终止液（0.1%EDTA）：称取1gEDTA，用去离子水稀释，定容至1000mL，室温保存。 6.11 阳性对照血清。 6.12 阴性对照血清。 7检验方法 7.1样品处理 采集静脉血1.5mL，分离血清备用。 7.2操作步骤 7.2.1血清稀释：用样本稀释液将样品和阴性、阳性血清作1：5稀释，涡旋混匀。 7.2.2准备膜：取出抗原膜，编号后置于平血中，加入15mL样本稀释液，置摇床上慢速摇动，室温封闭 30min，结束后将膜用1XPBS快速洗涤三次，每次1min，最后弃去洗液，然后在抗原膜下垫入一张渗 滤垫，注人少许0.1%PBST，确认膜和滤纸充分湿润，再倒出多余液体，直至膜上不挂液为止。 7.2.3贴膜：用尖头镊子轻夹一片载样条，将一端小心浸入样品稀释液中，待载样条吸附上液体后提出 液面，并将纸条在试管口轻刷1次～2次，去掉多余的液体，然后贴覆在抗原膜上。用吸水纸擦干镊尖， 再贴下二个样本。 7.2.4孵育：每张膜贴好后，盖上平血盖，置于水浴箱或恒温培养箱中37.0℃孵育30min。 7.2.5洗涤：用0.1%PBST冲去膜上的载样条，并取走渗滤垫后加适量0.1%PBST，置摇床上中速摇 该产品的认可。如果有其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。 2