SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3993—2014 箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范 Quarantine protocol for infection with batrachochytrium dendrobatidis 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3993—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准非等效部分采用世界动物卫生组织（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2012版）第2.1.1章等 有关章节。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：谢明星、彭小莉、石建平、刘棠、王群力、陈双雅、陈伟玲、许秋贝、孙福泉、 王景明。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 3993—2014 箭毒蛙壶菌感染检疫技术规范 1范围 本标准规定了箭毒蛙壶菌感染的临床诊断、实时荧光聚合酶链式反应检测方法。 本标准适用于箭毒蛙壶菌感染的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp:碱基对(basepair) DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate) FAM：荧光报告基团（Carboxyfluorescein） MGB：荧光萍灭基团（Minorgroovebinder) Real-timePCR：实时荧光聚合酶链式反应（real-timepolymerasechainreaction) Taq：水生热栖菌(Thermus aquaticu) 业标准信息服务平台 4 仪器和试剂 4.1 仪器 4.1.1冷冻离心机。 4.1.2 一20℃低温冰箱。 4.1.3 组织匀浆器。 4.1.4 实时荧光PCR反应管。 4.1.5 实时荧光PCR仪。 4.1.6 高压灭菌器。 4.1.7 紫外分光光度计。 4.2试剂 4.2.1水应符合GB/T6682中一级水规定 4.2.2含有箭毒蛙壶菌的DNA或含有扩增区域序列的质粒。 4.2.3 TaqManFastUniversalPCRMasterMix（含dNTP、Taq聚合酶和PCR反应缓冲液等）。 1 SN/T3993—2014 4.2.4蛋白酶K、酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1）、三氯甲烷/异戊醇混合液（24：1）、75%乙 醇和TE缓冲液（见A.1) 5临床诊断 般认为所有的两栖类均可感染，包括无尾目（青蛙和蟾蜍）、有尾目（蝶螈、水螈、鳗螈）和蚓螈目 （真蚓）所有成员。目前发现有14科250种以上两栖动物感染箭毒蛙壶菌感染。箭毒蛙壶菌感染在大 多数情况下没有明显的临床症状，只有那些快要死亡的动物表现明显。患病的成体蛙类腹部、髋部、腿 部皮肤出现弥散性红肿、局部轻度增厚和变色症状，后肢抽搐、身上积聚脱下的皮、脚部及其他部分的浅 表皮脱落、皮肤出现轻微粗化及细小的溃疡或出血。患者行为上表现无力、厌食、精神沉郁、不能找到遮 蔽处、不能逃跑、失去正常的反射作用及出现不正常姿势等神经症状。蝌蚪的口器变形和角质化可作为 箭毒蛙壶菌感染的检测依据。 6实时荧光PCR反应 6.1采样 根据GB/T18088的要求采集成年蛙的脚趾和腹部的皮肤、蝌的口器、成年蛙腹部的皮肤和蝌蚪 佳的器官和组织是成年蛙的腹部皮肤和脚趾，蝌蚪的口器。 6.2 核酸抽提 用经典的酚三氯甲烷萃取法（见附录B)或商业化DNA提取试剂盒。 6.3 引物和探针 引物序列： ITS1-3:5'-CCT-TGA-TAT-AAT-ACA-GTG-TGC-CAT-ATG-TC-3' 5.8S:5'-AGC-CAA-GAGATC-CGT-TGT-CAA-A-3' 探针序列： 5'-FAM-CGA-GTC-GAA-CAA-AAT-MGB-3 6.4 4PCR扩增体系 PCR扩增在标准的25uL的反应体系中进行，每个反应体系应设置三个平行反应。包括： V12.5 μL TaqMan Fast Universal PCR Master Mix(2X) ITS1-3引物(10μmol/L) 0.5 μL 5.8S引物(10μmol/L) 0.5 μL 探针（10μmol/L) 0.5 μl DNA模板(20ng/L100ng/L) 2.5μL 补水至25。 6.5 5PCR反应条件 45次。 2