SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3661—2013 口岸食源性疾病轮状病毒（A组） 荧光PCR检测 Detection for rotavirus (group A)of foodbrone disease by real-time fluorescence PCR at ports 行业标准信息服务平台 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3661—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国河北出人境检验检疫局 本标准主要起草人：史玲莉、韩伟、闫冀焕、沈军、王惠兰、董辉、崔鹰。 行业标准信息服务平台 SN/T3661—2013 口岸食源性疾病轮状病毒（A组） 荧光PCR检测 1范围 本标准规定了国境口岸食源性轮状病毒（A组）的荧光PCR快速检测方法，包括标本采集、运输与 保存、处理、核酸提取与检测、结果分析以及相应的生物安全措施。 本标准适用于国境口岸出入境腹泻惠者粪便样本、呕吐物和可疑食品的轮状病毒（A组）筛查检测 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.1一2003食品卫生微生物学检验总则 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1720一2006出入境口岸轮状病毒感染监测规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 轮状病毒rotavirus 属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起哺乳动物类和鸟类腹泻的主要病原体。轮状病毒是双链 轮状病毒主要引起儿童腹泻，B组轮状病毒主要引起成人腹泻。 3.2 荧光PCRfluorescencepolymerasechainreaction 又称为实时PCR（real-timePCR），是在普通PCR的基础上利用荧光染料在激发光作用下所释放 的荧光光能的变化来直接反映PCR扩增产物量变化的技术。本标准所采用的是TaqMan水解探针 法，其原理是在常规RT-PCR（反转录聚合酶链式反应）的基础上，加人一条特异性的荧光探针，该探针 为一段寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，探针完整时，报告基团发射的 荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切水解，使报告荧光 基团和萍灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，实现了荧光信号的积累与PCR产 物形成同步。 3.3 Ct值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的值时所经历的循环数 4仪器和设备 4.1荧光定量PCR仪。 SN/T 3661—2013 4.2 生物安全柜。 4.3普通冰箱（2℃~8℃和-20℃两种）。 4.4 超低温冰箱（一70℃）。 低速低温离心机（离心转速≥6200g）。 4.6高速冷冻离心机（离心转速≥13800g，4℃低温）。 4.7 微量可调移液器（10μuL、100μL、1000uL）及配套带滤芯吸头。 4.8离心管(1.5mL)。 4.9涡旋振荡器。 5试剂 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所用试剂均采用无RNA酶污染的容器（用DEPC 水处理后高压灭菌）分装。 5.1样本稀释液 商品化磷酸盐缓冲液（PBS：PhosphateBufferedSaline）（含Ca2+、Mg2+），pH7.2～7.4。也可参见 附录A.3配制。 5.2核酸提取试剂 选用病毒RNA提取试剂盒QIAampViralRNAKit试剂盒，德国Qiagan公司产品，内含AVL、 AW1、AW2、AVE等成分。 5.3核酸检测试剂 迅必达轮状病毒（A组）核酸检测试剂盒，成都新基因格生物科技有限公司产品1）。 业标准信 6标本的采集 6.1粪便标本 采用无菌螺口便盒采集腹泻患者粪便标本，每份标本5mL～10mL，用耐低温油性记号笔在便盒 上做好标记，置于一20℃保存。轮状病毒感染者出现症状后1d～3d内粪便排毒量最大，因此应尽可 能在此期间收集标本。 6.2呕吐物标本 并立即送检。 6.3可疑食品样本 并立即送检。 1） 可使用这些等效产品。 2