SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2206.11—2014 化妆品微生物检验方法 第11部分：金黄色葡萄球菌 多重实时荧光PCR法 Determination of microorganism in cosmetics-Part 11 : Multiplex fluorescent real-time PCR method for Staphylococcus aureus 标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2206.11—2014 前言 SN/T2206《化妆品微生物检验方法》共分为13部分： 第1部分：沙门氏菌； 第2部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌； 第3部分：肺炎克雷伯氏菌； 第4部分：链球菌； 第5部分：肠球菌； 第6部分：破伤风梭菌； 第7部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原； 第8部分：白色念珠菌； 第9部分：胆汁酸耐受革兰氏阴性菌； 第10部分：金黄色葡萄球菌PCR法； 第11部分：金黄色葡萄球菌多重实时荧光PCR法； 第12部分：绿脓杆菌PCR法； 第13部分：嗜麦芽窄食单胞菌。 本部分为SN/T2206的第11部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分主要起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 业标准信息服务平台 主部分主要起草人：许红岩、刘宁、王颖、尹伟力、鲁闽、段效辉、方绍庆、曹鹏、耿金培。 I SN/T 2206.11—2014 化妆品微生物检验方法 第11部分：金黄色葡萄球菌 多重实时荧光PCR法 1范围 本部分适用于化妆品中金黄色葡萄球菌的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 GB7918.1化妆品微生物标准检验方法总则 GB7918.5化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌 SN/T1193基因实验室技术要求 3术语、定义和缩略语 *业标准信数 下列术语、定义和缩略语适用于本文件 3.1术语和定义 3.1.1 Ct 值Cycle threshold Ct 3.2缩略语 Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticu） FAM:6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein） HEX：6-羧基-2，4，4，5,7,7-六氯荧光素（5-hexachloro-fluorescein） BHQ：黑洞淬灭基（Blackholequencher) 4检测方法 4.1方法原理 加入多对引物和与模板DNA匹配的、两端有荧光基团标记的寡核苷酸探针进行PCR反应。PCR 每进行一次循环，合成的新链数与释放的荧光基团数呈对应关系，即PCR产物的量与荧光信号的强度 呈对应关系。当荧光信号超过所设定的阈值时，荧光信号可被检测出来，仪器检测荧光信号的增加量可 1 SN/T 2206.11—2014 以间接地体现样品模板DNA的目的基因的扩增量。样品的模板DNA进行实时荧光PCR扩增，观察 实时荧光PCR的增幅曲线，从而对化妆品中金黄色葡萄球菌进行实时荧光PCR检测。 4.2设备和材料 4.2.1 实时荧光PCR仪。 4.2.2 冰箱：-20℃~4℃ 4.2.3 高速台式离心机（最高转速12000r/min以上）。 4.2.4 微量移液器和灭菌吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。 4.2.5 离心管：1.5mL。 4.2.6 恒温水浴锅。 4.2.7 天平：感量0.01g。 4.2.8 均质器。 4.2.9 灭菌锥形瓶：500mL、250mL。 4.2.10 生化培养箱：温度36℃士1℃。 4.2.11 高压灭菌器。 4.3培养基和试剂 除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水。所有试剂均用无DNA酶污染的容 器分装。 4.3.1水：应符合GB/T6682—2008中一级水的规格。 4.3.2 SCDLP液体培养基。 4.3.3 7.5%氯化钠肉汤。 4.3.4 TaqDNA聚合酶。 4.3.5dNTP:dATP,dTTP、dCTP dGTP 4.3.6 10XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH值为8.4），200mmol/L氯化钾（KCl)，15mmol/L 氯化镁（MgClz）。 4.3.7 DNA提取液：称取0.1gchelex100粉末，加人100mL灭菌蒸馏水中，摇匀。 准信息服务平台 4.3.8 三氯甲烷。 4.3.9 酚-三氯甲烷（体积比1：1）。 4.3.10 异丙醇。 4.3.11 75%乙醇。 4.3.12 阴阳性菌株或DNA 4.3.13 引物和探针：引物和探针序列见附录A。 4.4检测步骤 4.4.1 样品制备 不同类型化妆品样品的制备参照GB7918.1进行。 4.4.2 增菌培养 参照GB7918.5进行样品的增菌培养。 4.4.3增菌液模板DNA的制备 取4.4.2中培养的样品增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，轻轻倒去 2