SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4661—2016 施马伦贝格病检疫技术规范 Quarantine protocol for Schmallenberg disease 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4661—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国河北出人境检验检疫局、中华人民共 和国辽宁出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：张永宁、吴绍强、林祥梅、王娜、吕继洲、冯春燕、邓俊花、王建昌、胡传伟。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4661—2016 施马伦贝格病检疫技术规范 1范围 本标准规定了施马伦贝格病实时荧光反转录-聚合酶链式反应和阻断酶联免疫吸附试验的技术 规范。 本标准适用于施马伦贝格病的检疫。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 SBV：施马伦贝格病毒（Schmallenbergvirus） RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid) rRT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链式反应（Real-timereversetranscriptionpolymerasechainre action) Ct值：循环阈值（Cyclethreshold） ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzymelinkedimmunosorbentassay) McAb：单克隆抗体（Monoclonalantibody) TBST：含0.05%吐温-20Tris-盐酸缓冲液(Tris-bufferedsalinecontaining0.05%Tween20) OD值：光密度值（Opticaldensityvalue) 准信息服务平台 PI：阻断率(Percentage of inhibition） 4 施马伦贝格病概述 施马伦贝格病概述参见附录A。 5实时荧光反转录-聚合酶链式反应（rRT-PCR) 5.1 主要试剂与材料 5.1.1 TRIzol 试剂。 5.1.2无RNA酶水。 5.1.3 SBVRNA阴性对照、SBVRNA阳性对照：由标准起草单位提供含SBVN基因的假病毒。 1 SN/T 4661—2016 5.1.4rRT-PCR通用试剂:AgPath-IDTMOne-StepRT-PCRKit。 5.1.5引物：上游引物（5'-3'):TCAGATTGTCATGCCCCTTGC,下游引物（5°-3'）：TTCGGC CCC AGG TGC AAA TC。 5.1.6TaqMan 探针(5'-3'):FAM-TTA AGG GAT GCA CCT GGG CCG ATG GT-BHQ1。 5.1.7PCR反应管。 主要仪器设备 5.2.1 生物安全柜。 5.2.2 荧光PCR仪。 5.2.3 一70℃冰箱、一20℃冰箱、4℃冰箱。 5.2.4 高速冷冻离心机。 5.2.5 组织研磨器。 5.2.6 高压蒸汽灭菌器。 5.2.7 可调式微量移液器（0.5～10μ10~100μL100μL～1000L）。 5.3样品的采集 按照GB/T18088有关规定进行采样。疑似感染活动物可无菌采集EDTA抗凝血或不加抗凝剂 的血液（分离血清用）；对于产死胎或畸形胎的母畜可无菌采集羊水和胎盘；对于死胎或畸形胎可无菌采 集脑组织（主要为大脑和脑干）、心包液、羊水、吸初乳前的胎儿血液和胎粪。采样完毕后，应按规定填 写“送样单”，2℃～8℃运送至实验室进行检测。采样人员应严格按照GB19489做好生物安全防护。 5.4样品的处理 5.4.2血清：将采集的无抗凝剂血液呈45~60°角于室温静置1h、4℃冰箱静置1h3000r/min离心 5min，收集上清液，置一20℃保存备用。 5.4.3精液：将新采集的反乌动物精液用灭菌生理盐水做4倍稀释，商品化的反台动物精液不用稀释， 置一70℃保存备用。 5.4.4脑组织、胎粪：将采集的脑组织或胎粪样品置研钵内，加入5倍样品体积的含2%胎牛血清 DMEM进行研磨，置一20℃冰箱冻融2次，3000r/min离心5min，收集上清液，置一20℃保存备用。 5.4.5羊水、心包液：将采集的羊水或心包液，3000r/min离心5min，收集上清液，置一20℃保存备用。 5.5SBVRNA提取 5.5.1取250μL处理后的样品置1.5mLEppendorf离心管中，作好标记，同时设置阳性样品、阴性样 品对照，加人750uLTRIzol剧烈振荡，室温静置5min。 5.5.2加人250μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min；4℃12000r/min离心15min，将上层水相 淀 15 min。 5.5.34℃12000r/min离心15min，轻轻弃掉上清液，加1mLDEPC处理水配制的75%乙醇洗涤 沉淀。 1）美国LifeTechnologies公司产品，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果 其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2