SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4660—2016 鹿种鉴定技术规范 Identification technology protocol for deer species 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4660—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国农业科学院特产研究所、吉林农业 大学、吉林省中韩动物科学研究院 本标准主要起草人：贾赞、栾慎顺、孙铭英、王全凯、张雪、宋大贺、王凯英、徐超、胡传伟、袁文泽。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4660—2016 鹿种鉴定技术规范 1范围 本标准规定了梅花鹿、马鹿物种的PCR鉴定方法。 本标准适用于梅花鹿、马鹿及其产品的物种鉴定。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法原理 根据GenBank数据库中已公布的梅花鹿、马鹿的线粒体基因组序列，根据种内具有保守性、种间具 异性引物，对梅花鹿、马鹿的目的基因进行PCR扩增，根据PCR扩增结果判定样品中是否含有梅花鹿、 马鹿的基因。 4 形态特征 梅花鹿、马鹿形态特征参见附录A 行业标 5PCR检测 主要仪器设备 PCR仪、组织研磨器、超净工作台、制冰机、高速冷冻离心机、水浴锅、台式小型离心机、常规冰箱、 5.2 2试剂与材料 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682的规定。 5.2.1无水乙醇。 5.2.2蒸馏水（应符合GB/T6682中一级水的规格）。 5.2.3蛋白酶K（20mmol/μL）。 5.2.410%十二烷基磺酸钠（SDS)。 5.2.5十六烷基三乙基溴化铵（CTAB。 5.2.6氯化钠。 5.2.7 三氯甲烷。 5.2.8 异丙醇。 1 SN/T 4660—2016 5.2.9 Tris饱和酚 5.2.10 70%乙醇 5.2.11 TE缓冲液。 5.2.12 TaqDNA聚合酶 5.2.13 2.5 mmol/L dNTP。 5.2.14 10倍缓冲液（Mg2+PLUS）。 5.2.15 琼脂糖、电泳缓冲液等（试剂配制见附录B)。 5.2.16 引物对如下： DFP1：5-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3（扩增梅花鹿、马鹿通用上游引物） DRP2：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3（扩增梅花鹿、马鹿通用下游引物） 用双蒸水将引物稀释为20μmol/L工作浓度，一20℃保存备用。 5.3 检测方法 5.3.1样品的处理 5.3.1.1血液或精液样品：可直接使用200μL新鲜或冷藏、冷冻的均可 5.3.1.2动物组织、血凝块或毛发：100mg~200mg置于液氮中充分研磨，再将所研磨的材料取200μL 放入1.5mL的离心管中。 5.3.2 样品DNA的提取 注：可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，按操作说明书进行操作，也可采用以下方法提取DNA。 5.3.2.1取血液/精液或在液氮下充分研磨的组织样品，加人50μL10%SDS/12.5uL蛋白酶K，充分 混勺，65℃水浴加热10min。 5.3.2.2 加100μL65℃预热的CTAB，上下颠倒混匀，65℃水浴加热20min。 5.3.2.3加人等体积的Tris-饱和酚，混匀。 5.3.2.4取上层水相于新管.加人等体积的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）混勾，12000r/min室 温离心5min。 5.3.2.5 取上层水相于新管，加人等体积的三氯甲烷混匀，12000r/min室温离心5min。 5.3.2.6 取上层水相，加人1/10体积3mol/L的醋酸钠，混匀，再加人2.5倍体积的无水乙醇，混匀，置 于一20℃ 2h以上或过夜,12000r/min室温离心15min 5.3.2.7弃上清，加人1mL预冷的70%的乙醇，12000r/min室温离心5min。 5.3.2.8 吸弃残留液体，室温干燥10min左右，用50μLTE缓冲液或ddH,O溶解，一20℃保存备用。 5.3.3PCR扩增检测 5.3.3.1PCR反应体系组成 10XPCR缓冲液 5.0 μL dNTPs(2.5 mmol/L) 5.0 μL DFP1或RDFP3(20 pmol/μL) 1.0 μL DRP2(20 pmol/μL) 1.0 μL 样品DNA 2 μL ExTaqDNA聚合酶 0.5 μL 灭菌水 35.5mL 2