SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.2—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第2部分：短小芽孢杆菌 Methods for examination of import microbial blends in the environmental protection- Part2:Bacillus pumilus 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4624.2—2016 前 言 SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分： 第1部分：地衣芽孢杆菌； 第2部分：短小芽孢杆菌； 第3部分：巨大芽孢杆菌； 一第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌； 第5部分：β型溶血性链球菌； 一第6部分：金黄色葡萄球菌； 第7部分：沙门氏菌； 第8部分：志贺氏菌； 第9部分：致泻大肠埃希氏菌； 第10部分：淡紫拟青霉； 第11部分：雅致小克银汉霉； 第12部分：哈茨木霉； 第13部分：黄孢原毛平革菌； 第14部分：焦曲霉； 第15部分：解淀粉芽孢杆菌； 第16部分：类产碱假单胞菌； 第17部分：恶臭假单胞菌。 本部分为SN/T4624的第2部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：王芳、贾金生、张波、张明、李蓉娟。 标准信息服务平台 1 SN/T 4624.2—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第2部分：短小芽孢杆菌 1范围 SN/T4624的本部分规定了人境环保用微生物菌剂符合性检验短小芽孢杆菌的形态学鉴定、生化 鉴定、分子生物学检测方法 本部分适用于人境环保用微生物菌剂符合性检验短小芽孢杆菌检测和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 主要试剂和培养基 3.1 实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 3.2 营养琼脂：见附录A中A,1。 3.3 营养肉汤：见A.2。 3.4 革兰氏染色法相关试剂：见A.3。 3.5 接触酶：见A.4。 氧化酶：见A.5。 3.6 业标准信息服务平台 3.7 糖发酵管：见A.6。 3.8 柠檬酸盐：见A.7。 3.9 硝酸盐还原：见A.8。 3.10 淀粉水解：见A.9。 3.11 明胶：见A.10。 3.12 TE缓冲液（pH8.0)：见A.11。 3.13 1%~3%琼脂糖凝胶：见A.12。 3.14 25mmol/LEDTA:见A.13。 3.15 3mol/L醋酸钠：见A.14。 3.16 dNTP:dATP、dTTP,dGTP、dCTP。 3.17 TBE:见 A.15 3.18 Taq DNA 聚合酶 3.19 细菌基因组DNA提取试剂盒。 3.20 琼脂糖。 3.21 溴化乙锭。 3.22 DNA分子量标记：100bpDNAladder。 1 SN/T4624.2—2016 4主要仪器和设备 4.1 电子天平（感量0.01g）。 4.2恒温培养箱：36℃±1℃、50℃±1℃ 4.3恒温振荡培养箱：36℃±1℃。 4.4恒温水浴锅。 4.5 5台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 4.6 PCR扩增仪。 4.7 生物显微镜：10×100×。 4.8 厌氧培养装置：36℃±1℃ 4.9 微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200μL、1000μL。 4.10 高压灭菌锅。 4.11 PCR超净工作台。 4.12 电泳仪。 4.13 核酸/蛋白分析仪。 4.14 凝胶成像系统。 4.15 无菌培养皿：直径90mm。 5样品制备、培养 5.1 以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL生理盐水中混匀，移取1环菌连续划线接种5个营养 对照。 5.2挑取平板上3～5个白色或淡黄色、半透明或不透明、边缘光滑的菌落进行形态学鉴定。 5.3挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯培养，36℃土1℃条件下培养18h～24h；再从纯 培养平板上挑取菌落接种营养肉汤，36℃土1℃条件下180r/min振荡培养18h24h。 业标准食 6形态学鉴定 6.1培养性状 短小芽孢杆菌在营养琼脂上的菌落颜色由白色到淡黄色，半透明到不透明，表面及边缘一般多为 光滑。 6.2形态特征 革兰氏染色及芽孢染色：将5.2中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色和芽孢染色，镜检。 短小芽孢杆菌为革兰氏阳性杆菌，菌体宽度0.6um～0.7um，长度2.0μm～3.0μm，内生孢子，芽 孢不膨大，不形成伴胞晶体。 7生化鉴定法 取5.2中菌液利用细菌微量生化鉴定管进行生化鉴定，每个生化管加入100μL增菌肉汤。 短小芽孢杆菌生化特征见表1。 2