SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4624.16—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第16部分：类产碱假单胞菌 Methods for examination of import microbial blends in the environmental protectionPart 16:Pseudomonas pseudoalcaligenes 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4624.16—2016 前言 SN/T4624《人境环保用微生物菌剂检测方法》共分为17部分： 第1部分：地衣芽孢杆菌； 第2部分：短小芽孢杆菌； 第3部分：巨大芽孢杆菌； 一第4部分：嗜酸氧化亚铁硫杆菌； 第5部分：β型溶血性链球菌； 第6部分：金黄色葡萄球菌； 第7部分：沙门氏菌； 第8部分：志贺氏菌； 第9部分：致泻大肠埃希氏菌； 第10部分：淡紫拟青霉； 第11部分：雅致小克银汉霉； 第12部分：哈茨木霉； 第13部分：黄孢原毛平革菌； 第14部分：焦曲霉； 第15部分：解淀粉芽孢杆菌； 第16部分：类产碱假单胞菌； 第17部分：恶臭假单胞菌。 本部分为SN/T4624的第16部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：耿庆华、徐宜宏、刘瑜、于洋、微微、韩宏乾、林颖、王芳。 标准信息服务平台 1 SN/T 4624.16—2016 入境环保用微生物菌剂检测方法 第16部分：类产碱假单胞菌 1范围 SN/T4624的本部分规定了人境用环保微生物菌剂符合性检验类产碱假单胞菌的形态学鉴定、生 化鉴定、普通PCR检测方法。 本部分适用于人境用环保微生物菌剂符合性类产碱假单胞菌检测和鉴定、 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 主要试剂和培养基 3.1 实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。 3.2 营养琼脂：见附录A中A.1。 营养肉汤：见A.2。 3.4 革兰氏染色液：见A.3。 3.5 显色培养基：见A.4。 3.6 TE缓冲液（pH8.0）.见A.5。 3.7 10XPCR缓冲液:200mmol/LTris-HCl(pH8.4）),200mmol/L氯化钾（KCI),15mmol/L氯化 镁(MgClz)。 3.8dNTP:dATP,dTTP、dGTP、dCTP。 3.9 TBE:54gTris,27.5g硼酸，800mL去离子水溶解，20mL0.5mol/LEDTA(pH8.0)定容至 息服务平台 1 L。 3.10 TaqDNA聚合酶。 3.11 细菌基因组DNA提取试剂盒。 3.12 50×TAE缓冲液（pH8.5）：见A.6。 3.13琼脂糖。 3.14溴化乙锭。 3.15DNA分子量标记：100bpDNAladder。 4主要仪器和设备 4.1 电子天平（感量0.01g）。 1 SN/T 4624.16—2016 4.2 2恒温培养箱：30℃±1℃，36℃±1℃。 4.3恒温水浴锅。 4.4台 台式冷冻离心机（最高转速15000r/min）。 4.5PCR扩增仪。 4.6实时荧光PCR仪。 4.7 微量移液器和灭菌吸头：10μL、20μL、200μL、1000μL。 4.8 高压灭菌锅。 4.9 9PCR超净工作台。 4.10电泳仪。 4.11 核酸/蛋白分析仪。 4.12 凝胶成像系统， 4.13 无菌培养皿：直径90mm。 5样品制备 5.1[ 以无菌操作取1g（mL）样品加人到100mL生理盐水中混匀，移取1环菌连续划线接种5个假单 胞菌显色培养基平板，30℃土1℃培养24h，观察菌落形态特征。取样过程中，在样品旁边放置1个假 单胞菌显色培养基平板作为空白对照。 5.2挑取平板上3个～5个单菌落进行形态学鉴定，并挑取符合形态学特征单菌落转营养琼脂平板纯 培养，30℃土1℃培养18h～24h，再从纯培养平板上挑取菌落接种营养肉汤，恒温培养箱内增菌培养 18h24h进行生化鉴定以及分子生物学检测的模板DNA提取。 6形态学鉴定 6.1革兰氏染色 将5.2中平板上的菌落做涂片进行革兰氏染色，镜检。 6.2形态特征 该菌在假单胞菌显色培养基上培养24h形成圆形光滑、湿润黏稠、蓝绿色菌落。革兰氏染色为阴 7生化鉴定 生化鉴定法 7.2 生化特征 类产碱假单胞菌生化特征详见表1。 2