SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4290—2015 多子小瓜虫检疫技术规范 Quarantine protocol for Ichthyophthirius multifiliis 行业标准信息服务平台 2015-09-02发布 2016-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4290—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国海南 出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郭书林、陈信忠、吴山楠、龚艳清、杨俊萍、黄纪徽、孔凡德。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4290—2015 多子小瓜虫检疫技术规范 1范围 本标准规定了多子小瓜虫的临床诊断、形态学诊断和PCR检测方法。 本标准适用于多子小瓜虫病的病原鉴定及其流行病学调查和监测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 滋养体 trophont 成虫adult 多子小瓜虫的寄生阶段，指感染期幼虫从进入鱼的皮肤或鳃，至发育成熟并离开鱼体的阶段。 3.2 包囊 tomont 寄生于宿主的滋养体脱离宿主在水中自由活动形成包囊 3.3 幼虫theront 包囊连续分裂形成大量幼虫，幼虫破囊而出，长大形成感染期幼虫。 4疾病概述 由多子小瓜虫（Ichthyophthiriusmultifiliis）寄生鱼体引起的传染病称为多子小瓜虫病（ich thyophthiriasis），又称白点病。该虫对大多数淡水和半咸水鱼类都易感。鱼类因该虫的感染，以及因该 虫造成的损伤继发其他病原的感染，可造成大批死亡。多子小瓜虫病详细内容参见附录A 5试剂和材料 5.1所有化学试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。用于DNA提取及 PCR实验的水需用灭菌双蒸水。 5.2绍丁氏固定液（Schaudinn'ssolution）（配制见附录B中B.1）。 1 SN/T4290—2015 5.3 3波恩氏固定液（Bouin'ssolution)（配制见B.2）。 5.4海登汉铁苏木精染色液（Heidenhain'sironhaematoxylin）（配制见B.3）。 5.510%的甘油乙醇（配制见B.4）。 5.6Taq酶、dNTPs(含dATP、dUTP、dCTP、dGTP)等PCR所需试剂可选用商品化试剂和试剂盒。 5.7阳性对照为多子小瓜虫滋养体。 5.8 CATAAAT-3'。 5.9CTAB溶液（配制见B.5）。 5.10抽提液1(配制见B.6）。 5.11 抽提液2（配制见B.7）。 5.12 TBE电泳缓冲液（配制见B.8）。 5.13 核酸染色剂（EB)（配制见B.9）。 5.14 上样缓冲液（配制见B.10）。 6 器材和设备 6.1普通PCR仪。 6.2显微镜。 6.3立体显微镜。 6.4高速冷冻离心机。 6.5解剖器具。 6.6 5微量移液器。 6.7电泳仪。 6.8凝胶成像分析系统或紫外检测仪 6.9 载玻片和盖玻片。 7 临床诊断 多子小瓜虫对大多数淡水和半咸水的不同年龄段鱼类都易感，其中，对鱼苗、鱼种、观赏鱼类及越冬 后期的鱼种等影响严重。主要寄生于鱼的皮肤、鳍、鳃和口腔等部位。 鱼体感染多子小瓜虫病时，其皮肤、鳍条和鳃瓣上形成许多直径1mm左右的小白点，严重时，躯 干、头、鳍、鳃和口腔等处都布满小白点，体表似覆盖一层白色薄膜，有时眼角膜上也有小白点，并伴有大 量黏液覆盖于体表和鳃丝（参见附录A）。因黏孢子虫病、打粉病等多种病，其体表症状与多子小瓜虫病 相似，所以临床诊断法仅可作为初步诊断 8实验室诊断 8.1 虫体的收集 收集从鱼体脱落沉集于容器底部的多子小瓜虫，或从活鱼皮肤、鳍、鳃、头、鳞片、角膜、口腔、眼、鼻 等部位刮取组织样本。显微镜观察用虫体可用5%福尔马林固定保存；PCR检测用虫体和鱼体组织可 保存于70%的乙醇中，或于一20℃以下冻存备用。 2