SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4289—2015 斑点叉尾病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for channel catfish virus disease 行业标准信息服务平台 2015-09-02发布 2016-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4289—2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准修改采用了OIE《水生动物疾病诊断手册》（2006版）中2.1.6：斑点叉尾鲫病毒病。 本标准与OIE《水生动物疾病诊断手册》（2006版）2.1.6相比，主要差别如下： 将ELISA流程中的封闭液由脱脂奶粉改为1%明胶； 一去除了在ELISA待检样品中加人TritonX-100的步骤，增加了H,O，去除非特异性过氧化物 酶的步骤； 一修改了ELISA检测流程中PBST的洗涤次数； 增加了酚氯仿法抽提病毒核酸的内容； -将内控DNA的长度改为186bp。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局 本标准主要起草人：张曼、王娜、张利峰、景宏丽、吴绍强、邓俊花 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4289—2015 斑点叉尾病毒病检疫技术规范 1范围 本标准规定了斑点叉尾鲫病毒病临床症状、病原分离、中和试验、酶联免疫吸附试验和聚合酶链式 反应的检测方法。 本标准适用于斑点叉尾鲫病毒病的检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3概述 斑点叉尾鲫病毒病（channelcatfishvirusdisease，CCVD）是由斑点叉尾鲫病毒（channelcatfishvi- rus，CCV)感染斑点叉尾鲫等温水鱼而引起的病毒性疾病，发病死亡率可达100%。该病曾被世界动物 卫生组织（OIE)列人水生动物疫病名录，我国农业部和国家质量监督检验检疫总局将该病列人《中华人 民共和国进境动物检疫疫病名录》二类传染病（参见附录A）。 4 设备和器材 行业标准信息服务平台 4.1 倒置显微镜。 4.2 生化培养箱。 4.3 普通冰箱和低温冰箱 4.4 离心机和离心管。 4.5 超净工作台。 4.6 PCR仪。 4.7 电泳仪。 4.8 凝胶成像仪。 4.9 酶标仪。 5 试剂和材料 5.1 水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 5.2 CCV病毒参考株（阳性对照），由国家指定机构提供。 5.3羊抗CCV的IgG，由国家指定机构提供 5.4 鼠抗CCV的单克隆抗体，由国家指定机构提供。 5.5 内控DNA，是一段长186bp的人工合成DNA片段，其两端的序列和CCV的引物序列互补。由 1 SN/T4289—2015 检测实验室合成，或购买商品化试剂。 5.6斑点叉尾鲫卵巢细胞（CCO)。 5.7Taq酶：5U/μL。-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 5.8dNTP:含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L，一20℃保存。 5.9引物：引物浓度为50pmol/μL。引物序列： F:5'-TCA TCC GAA TCC GACAAC TGA-3" R:5'-CCA AGA TCG CGG AGA AAC-3' 扩增CCV蛋白激酶基因序列中136bp片段。 5.10无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。 5.11琼脂糖：电泳纯。 5.12封闭液：1%明胶 6临床症状 病鱼摄食活动减弱，挛式旋转游动，头上尾下悬挂于养殖池边缘，最后沉人水底衰竭而亡。病鱼 皮肤及鳍条基部出血，腹部膨大，腹水增多，呈现淡黄色。鳃丝苍白或出血，眼球突出。肾苍白肿大，肌 肉、肝、肾及脾出血，肝、肾及脾肿大，胃内充满黏液样分泌物，腹膜水肿，腹腔内充满黄色渗出物。 7采样 7.1采样要求 采样时水温应在20℃以上，挑选有典型临床症状的病鱼或者濒死鱼进行检测。 7.2 采样部位 送到实验室的应是活鱼。若体长≤3cm的鱼苗，取整条鱼；体长3cm～6cm的鱼苗取内脏（包括 肾）；体长大于6cm的鱼则取肾和脾， 8病毒的分离 8.1样品处理 1000μg/mL链霉素的培养液（参见附录B中B.1)中。25℃下孵育2h～4h，或4℃下孵育过夜，以释 放病毒。8000g离心20min，收集上清液 8.2病毒接种与观察 8.2.1对1：10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将1：10、1：100和1：1000三个稀释度 的上清液分别接种到生长约24h的CCO单层细胞上（96孔板中），每稀释度至少2孔，每孔接种 100μL。25℃～30℃吸附1h后，不弃去接种液，直接加入细胞培养液，置于25℃～30℃培养。试验 中要有2孔阳性对照（接种CCV参考株）和空白对照（未接种病毒的细胞）。 8.2.2阳性对照和待测样品都接种细胞后，10d内每天用40倍100倍倒置显微镜检查。整个培养阶 段维持细胞培养液的pH值在7.3～7.6之间 2