SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4074—2014 燕麦全蚀病菌检疫鉴定方法 Detection and indentification of Gaeumannomyces graminis var.avenae 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4074—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国黄埔出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验 检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：莫瑾、龚强、田茜、王昕、白雪、姜金林、周慧平、彭梓、谭建锡、钟国强、章桂明、 张祥林、朱金国。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4074—2014 燕麦全蚀病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了燕麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminisvar.avenae）的检疫鉴定方法 本标准适用于禾本科植物、草本植物的种苗、种子及混杂的植物残体中的燕麦全蚀病菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1809进出境植物种子检疫规程 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T2589植物病原真菌检测规范 燕麦全蚀病菌基本信息 学名：Gaemannomydesgraminisvar.avenae(E.M.Turner)Dennis 分类地位：子囊菌亚门（Ascomycotina）、核菌纲（Pyrenomycetes）、球壳菌目（Sphaeriales）、间座壳 科（Diaporthaceae）、顶囊壳属（Gaeumannomyces）、禾顶囊壳菌（Gaeumannomycesgramims）。 传播途径：病菌以菌丝体在病株组织或病残体在土壤中越冬（越夏）。禾草的整个生育期及其各个 部位均可受到侵染。 燕麦全蚀病菌的其他信息见附录A。 4方法原理 根据植株的植株病状进行现场检验，并采用形态学特征、分子生物学和致病性测定对植物种苗、植 物种子及混杂的植物残体中的燕麦全蚀病菌进行判定。 5仪器和耗材 5.1 仪器设备 PCR仪、超净工作台、体视显微镜、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离 心机、超低温冰箱、人工气候培养箱、常规冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、酶 标仪。 5.2 2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、Taq DNA聚合酶,PDA培养基、PDB培养基、0.001%吐温20-磷酸盐缓冲液见附录B。 1 SN/T 4074—2014 6抽样 按照SN/T1809及SN/T2122规定进行取样。 7病菌的鉴定 7.1种苗检验 7.1.1症状检查 观察植株是否带有典型或疑似全蚀病的症状，症状见第A.2章。 7.1.2形态学特征 切取生长有典型或疑似症状植株的染病部位，进行菌丝体和子囊壳的观察，对子囊壳进行徒手切片 镜检。 菌丝体形态有两种，少数为纤细而灰色，大多数是厚壁、粗壮的黑褐色菌丝，菌丝体常形成黑色的菌 丝束、菌丝团，多呈锐角分支、在主支和侧支交界处各产生一横隔形成“入”形的菌丝体（见第C.2章）。 瓶梗和瓶梗孢子：较多的是单个的瓶梗侧生在菌丝上，也有松散地集生在菌丝的分支处或菌丝未端呈穗 状。瓶梗基部窄缩，中下部较宽、向上渐窄，端部为领带状。瓶梗孢子为（3μm7um）×（1μm~ 2um），弯曲呈新月形或半月形。 子囊壳理生于叶鞘内，烧瓶状，有弯曲的柱状喙部伸出于寄主组织之外，子囊壳表面有栗褐色毛绒 状物，子囊壳黑色，直径330μm～550μm。子囊28个，子囊平行排列于子囊腔内，棒状，无色，直形或 弯曲，有多数线状侧丝，子囊大小为（110um～150um）×（12um~16um）（见附录C.3）。接触液态水 时，子囊壁溶化，子囊孢子射出。子囊孢子成束或分散排列，丝状，无色，略弯，多胞有3～7个假隔膜， （110μm～130um）×（2.5μm～3.5um）。有时子囊孢子萌发时，产生小形单胞、镰形或新月形分生 孢子。 7.1.3病原菌的分离培养 取待检样品的根、茎基部或叶鞘等部位（如有明显染病症状的部位应取染病部位）切成1cm长的小 段，用蒸馏水冲洗掉表面的泥土杂物后：用0.1%次氯酸钠或70%乙醇消毒1min～2min，无菌水冲洗 3次后，滤纸吸干水分，用灭菌解刀横切成1mm~5mm的小片，放置在PDA培养基上，每皿5～ 10片，25℃±1℃培养3d~10d，全蚀病菌在PDA培养基上生长菌落特征为：培养3d~5d菌落生长 出白色絮状菌丝团，然后菌落逐渐产生暗黑色菌丝束，迎光观察菌丝束组成的菌落似绒毛毯状（见 第C.1章）。将典型或疑似菌落纯化后进行进一步鉴定。 7.1.4分子生物学鉴定 直接取有明显症状的植物组织进行总DNA提取，也可取培养基上生长的菌丝体进行DNA提取。 提取方法见附录D。若使用提取试剂盒则按照试剂盒说明进行提取。 两种方法收集菌体：一种是当纯化后菌丝长满培养基表面时，直接从平板上刮取菌丝；另一种是从 平板上挑菌饼到液体PDB培养基中，28℃，180r/min振荡培养5d~7d，过滤收集菌丝，经冷冻抽干收 集干燥的菌丝，一20℃保存备用。 提取得到的DNA按照附录D进行分子生物学鉴定。 2