SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3989—2014 蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范 Quarantine protocol for acute bee paralysis of honey bees 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3989—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、吉林大学、中华人民共和国福建出人境 检验检疫局。 本标准主要起草人：宋战昀、冯新、王振国、郑腾、刘金华、孟日增、魏春艳、孟庆峰、肖成蕊、王伟利。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 3989—2014 蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范 1 范围 本标准规定了蜜蜂急性麻痹病的病原检测，包括病原透射电子显微镜观察、RT-PCR方法、荧光 RT-PCR方法。 本标准适用于蜜蜂急性麻痹病的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088出入境动物检疫采样 3现场检疫 3.1蜂群检查 对待检的所有蜂群进行箱外观察，观察蜂群的行为是否异常、箱外是否有不正常的虫尸和有残翅的 幼蜂爬行等，从中把可疑有病的蜂群挑出来，进一步进行箱内检查， 3.2 2箱内检查 提脾观察，主要查看箱内有无异常的拖弃物，蜜蜂是否有行为、形态等方面的异常。封盖是否异常， 巢脾上幼虫是否有病态表现及是否有死幼虫，幼虫或成年蜂身上是否携带有寄生物等。 3.3 3个体检查 抽检蜂箱内蜜蜂及巢门前的死蜂，拉出中肠检查是否有病变症状，若囊内充满蜜汁、中肠呈乳白色 信息服务平台 并失去弹性、后肠积蓄黄褐色粪便则为疑似患蜜蜂急性麻痹病，及时把患病或疑似患病的蜂群撤离隔离 场，并采样送实验室进一步确诊。 4实验室诊断 4.1 透射电子显微镜观察 4.1.1设备 透射电子显微镜（放大倍数：30万倍）、台式冷冻高速离心机、微量可调移液器（100μL1000μL、 4.1.2材料和试剂 4.1.2.1 PBS。 1 SN/T 3989—2014 4.1.2.2 三氯甲烷。 4.1.2.33%磷钨酸溶液。 4.1.2.4滤纸。 4.1.2.5洁净玻璃。 4.1.2.6铜网。 4.1.3样品采集 4.1.3.1成蜂样品的采集和保存 依据GB/T18088，现场检疫对有临床症状的蜂群，用灭菌后的镊子挑取蜂箱内巢脾上或蜂箱底部 快转移到液氮中保存，供检测用。无临床症状的蜂群，随机挑取箱内蜜蜂20～30只，分别装人无菌的容 器中，尽快转移到液氮中保存，供检测用。 4.1.3.2幼虫样品的采集和保存 依据GB/T18088，有临床症状的蜂群，无菌割取一小块带有病虫或死虫的巢脾（不小于20cm²）， 或无菌挑取单个病虫或死虫若干只装入无菌的小试管内，尽快转移到液氮中保存供检测用。无临床症 状的蜂群，随机无菌挑取幼虫若干只分别装入无菌的小试管内，尽快转移到液氮中保存，供检测用。 4.1.4、样品处理 患病蜜蜂或幼虫3～5只，与2mL的PBS(pH7.6）混匀，充分研磨，再加人等量的三氯甲烷，勾浆 10min，然后5000r/min离心10min，取上清加入等体积的三氯甲烷，在37℃～40℃水浴中振摇 10min，5000r/min离心10min，上清继续用此法处理2~4次。取上清，15000r/min离心30min，取 上清，35000r/min离心1h，弃去上清，用适量PBS重悬沉淀即为病毒悬液。 4.1.5透射电镜观察 4.1.5.1取病毒悬液，滴一小滴于腊盘上。取铜网使有支持膜的表面与样品液表面接触，静置3min～ 5min，取出铜网，用滤纸吸去多余的液滴，稍晾干。 4.1.5.2取2%醋酸铀溶液，滴一小滴于腊盘上。吸附有样品的铜网放置于染液表面（样品与染液接 触），静置3min～5min。取出铜网，用滤纸吸去多余的液滴，白炽灯下晾干。 4.1.5.3置于透射电子显微镜下观察，观察条件一般为加速电压：80kV～100kV，放大倍数：20万~ 30万倍，观察和记录病毒粒子形态、结构、长度和直径，并拍摄病毒粒子照片 4.1.6结果判定 蜜蜂急性麻痹病病毒粒子电镜照片参见附录A。 若发现均一的直径为28nm～30nm，呈球型二十面体的病毒粒子，可初步判断为急性麻痹病病毒。 若发现长短不一的椭圆形不等轴病毒粒子，长30nm～65nm，宽22nm，可初步判断为慢性麻痹病病毒。 病毒的进一步确诊，须结合待检样品的现场检疫、生物学特性或分子生物学检测结果进行鉴定。 4.2RT-PCR方法 4.2.1设备 梯度PCR扩增仪、台式冷冻高速离心机、微量可调移液器（100μL～1000μL、20μL～200μL、 2μL~20μL、0.5μL~10μL）、电泳系统、凝胶成像仪系统、电子天平（感量0.01g）。 2