SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3964—2014 番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Tomato severe leaf curl virus 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3964—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共 和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验 检疫局。 本标准主要起草人：张永江、邓丛良、沈建国、廖富荣、栗智平、鲁洁、朱水芳、李明福、李桂芬、魏梅生。 行业标准信息服务平台 SN/T3964—2014 番茄严重曲叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了番茄严重曲叶病毒的免疫学及分子生物学等检疫鉴定方法。 本标准适用于可能携带番茄严重曲叶病毒的寄主植物及其产品的检疫鉴定。 2番茄严重曲叶病毒基本信息 学名：Tomatosevereleaf curlvirus 缩写：ToSLCV 分类地位：双生病毒科（Geminiviridae），菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。 传播途径：主要通过烟粉虱（Bemisiatabaci）传播，也可通过嫁接传播。 番茄严重曲叶病毒的其他信息参见附录A。 3原理 根据番茄严重曲叶病毒与抗体之间的特异性反应，对样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附（DAS ELISA)检测；根据该病毒DNA保守区的特异性进行常规PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大 小或扩增曲线的变化进行结果判定。 行业标、 4仪器设备、用具及试剂 4.1仪器设备 酶标仪、普通PCR仪、实时荧光PCR仪、多功能电泳仪、高速冷冻离心机、凝胶成像系统、4℃冰 箱、电子分析天平（0.001g）、恒温水浴锅、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅及制冰机等。 4.2主要用具 可调移液器（2.5μL、10μL、20μL、100μL、1000μL）、离心管、PCR管、酶标板及研钵等 4.3主要试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂。 双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA)试剂见附录B,常规PCR检测试剂见附录C。 5检疫鉴定方法 5.1检测样品的制备 5.1.1苗木：有症状（如植株矮化、叶片畸形、卷曲、皱缩等）的苗木单独编号，每株采集症状叶片5g用 于后续检测；无症状的植株每10株分为1组并编号，混合采集植株顶部叶片5g用于后续检测。 1 SN/T 3964—2014 5.1.2植物产品：有症状的植物产品单独编号，取症状部位0.5g用于后续检测；无症状或无法观察症 状的植物产品，分组编号后混合采样0.5g用于后续检测。 5.2双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA） 具体操作步骤见附录B。 5.3常规PCR检测 提取样品DNA，设置阳性对照、阴性对照和空白对照，进行常规特异引物PCR检测或常规通用引 物PCR检测。具体操作步骤见附录C。 5.4实时荧光PCR检测 提取样品DNA，设置阳性对照、阴性对照和空白对照，进行实时荧光PCR检测。具体操作步骤见 附录D。 6 结果判断 同时符合双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）和常规特异引物PCR检测结果为阳性的， 判定待检测样品携带番茄严重曲叶病毒。 采用常规通用引物PCR进行检测，当检测结果为阳性时，则进行序列测定，测定序列经比对分析为 番茄严重曲叶病毒的，判定待检测样品携带番茄严重曲叶病毒。 实时荧光PCR检测结果为阳性的，判定待检测样品携带番茄严重曲叶病毒。 7样品保存与记录结果 7.1样品保存 检测结果判定为阳性的样品应妥善保存在一80℃冰箱中，并作好登记和标记，以备复核用。 7.2结果记录 息服务平台 包括样品来源、种类、取样人员、检测原始记录、照片等文档按有关规定作好登记、标记和存档，以便 必要时复核。 2