SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2980—2011 动物产品中牛、山羊和绵羊源性 成分三重实时荧光PCR检测方法 Triple fluorescent real-time PCR detection method for bovine, goat and sheep derived materials in animal products 行业标准信息服务平台 2011-09-09发布 2012-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2980—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：曾少灵、秦智锋、曹琛福、张彩虹、卢体康、孙洁、阮周曦、杨俊兴、陶虹、陈兵、 林庆燕、陈书琨、宗卉、花群义、刘建利、廖立珊。 行业标准信息服务平台 SN/T 2980—2011 动物产品中牛、山羊和绵羊源性 成分三重实时荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了采用实时荧光PCR检测方法同时检测动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分。 本标准适用于动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T14699.1饲料采样标准 SN/T2123出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3试剂与材料 3.11 DNA提取用试剂 3.1. 1 三氯甲烷。 3. 1. 2 Tris饱和苯酚和三氯甲烷1：1混合液 3. 1. 3 异戊醇。 3.1. 4 三氯甲烷和异戊醇24：1混合液。 3.1.5 异丙醇。 3. 1. 6 3mol/L乙酸钠溶液。 3. 1. 7 75%乙醇。 3.1.8 正已烷。 3. 1.9 3. 1. 10 0.5mol/L、pH8.0的乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Naz）溶液。 3.1.11 裂解液I。 3.1.12 pH8.0的Tris-EDTA(TE)缓冲液。 3.2 荧光PCR反应用试剂 3.2.1TaqDNA聚合酶（5U/μL）及10XPCR反应缓冲液（含25mmol/LMg²+）。 3.2.2 各引物溶液的使用浓度均为10μmol/L： a）牛源性成分检测用引物（对)序列为： 5′-TGGAGTAATCCTTCTGCTCACAGT-3" 5'-TGACTGTTGCTCCTCAGAATGATA-3 b）山羊和绵羊源性成分检测通用引物（对）序列为： 5'-AGAAACATGAAACATC(T)GGA-3 1 SN/T2980—2011 5′-ATATGGAATTGCTGAAAGAA(G)-3 3.2.3各探针溶液的使用浓度均为10μmol/L： a）牛源性成分检测用探针序列及标记物为： FAM-5’-AGCATTTATAGGATACGTCC-3'-MGB b）山羊源性成分检测用探针序列及标记物为： ROX-5'-TCCTGCTCGCAACAATGGC-3'-MGB c） 绵羊源性成分检测用探针序列及标记物为： HEX-5'-TCCTATTTGCGACAATAGC-3'-TAMRA 3.2.4各10mmol/L的四种脱氧核糖核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）混合溶液。 3.3材料 实时荧光PCR反应管。 4仪器设备 4.1实时荧光PCR检测系统。 4.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 4.31%电子天平。 4.4 高速离心机：离心力至少达到12000g。 4.5 微量移液器：0.25μ~10μL，10μL~100μL，10μL~200μL，100μL~1000μL。 4.6 恒温水浴锅。 4.7 微量振荡器。 4.8掌式离心机。 5样品制备 5.1饲料样品按照GB/T14699.1进行采样，将试样充分粉碎，混合均匀后待用。 5.2其他动物产品样品按照SN/T2123进行采样，将试样充分研磨，混合均匀后待用。 5.3固体样品要充分粉碎，保证颗粒大小在100目（即0.125mm）以下。 6DNA提取 6.1样品DNA提取 65℃水浴30min，每隔10min振荡混匀一次；100℃沸水浴5min；12000r/min离心5min，吸取上清液 至一新离心管中，加400L三氯甲烷+异戊醇混合液（见附录A），充分混匀；12000r/min离心5min， 吸取上清液至一新离心管中，加0.8倍体积的异丙醇，一20℃低温下沉淀DNA30min；12000r/min离 心10min，弃去上清液；75%乙醇（见附录A）轻柔地洗涤沉淀一次，12000r/min离心8min，倒去液体， 晾干；加入50μL～100μL的TE（见附录A），充分溶解沉淀。本标准采用直接从牛、山羊和绵羊肉中提 取的DNA作为阳性对照模板，因此可参照肉品的DNA提取方法进行阳性对照模板的提取。 6.2DNA浓度和纯度的测定 取5μL的DNA模板溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 2