SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2545—2010 动物源性食品中热变性蛋白检测方法 Testing method of thermal denaturation protein in animal derived food 行业标准信息服务平台 2010-03-02发布 2010-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2545—2010 前 言 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：高宏伟、梁成珠、郑文杰、孙敏、贺艳。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 行业标准信息服务平台 I SN/T2545—2010 动物源性食品中热变性蛋白检测方法 1范围 本标准规定了动物源性食品中热变性蛋白检测的SDS-聚丙烯酰胺电泳法和乳酸脱氢酶活性测 定法。 本标准适用于检验动物来源的食品是否达到规定的加热温度和加热时间。 SDS-PAGE电泳检测方法适用于各种新鲜和加人烹饪调料的猪、牛、鸡、鸭、羊来源的肉类制品加 热终点温度的检测。检测的加热温度在65℃~80℃。 乳酸脱氢酶活性测定方法适用于没有加人调味料和没有腌制过的猪、牛、鸭、羊来源的肉类制品在 加热终点温度的检测。检测的加热温度在65℃~80℃。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所 有的修改单（不包括勘误内容）或修订版均不适用于本标准，然后，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本标准。 3.1术语 3. 1. 1 动物源性食品animalderivedfood 猪、牛、鸡、鸭、羊来源的肉制品。 3. 1. 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis 在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按质量 比结合成复合物，使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电 荷效应，使蛋白分子相对迁移率（R"<[m]>）的大小完全取决于分子量的高低。 3. 1. 3 热变性蛋白thermaldenaturationprotein 蛋白质中有一部分是热稳定蛋白，另外一部分是热不稳定蛋白。热不稳定蛋白在经过一定温度和 3.2缩略语 3.2.1SDS-PAGE Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3.2.2SDS Sodium dodecylsulfate 十二烷基硫酸钠，阳离子表面活性剂。 3.2.3Tristris(hydroxymethyl)aminomethane 三（羟甲基）氨基甲烷。 SN/T2545—2010 3.2.4TEMED N,N,N,N-Tetramethyl-Ethylenediamine 四甲基乙二胺。 3.2.5LDHLactic dehydrogenase 乳酸脱氢酶。 4原理 4.1SDS-PAGE电泳检测方法 当蛋白质受到热或受到其他物理及化学作用时，其特有的结构会发生变化，使其性质也随之发生改 变，如溶解度降低，对酶水解的敏感度提高，失去生理活性等，这种现象称为变性作用。变性并不是蛋白 质发生分解，而仅仅是蛋白质的二、三、四级结构发生变化。动物蛋白加热后热不稳定蛋百高级结构变 化并且在相对分子质量上体现出来。只有部分热稳定蛋白在加热前后的相对分子质量不变。SDS-聚 丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。动物源的肉食品中经过一定温度和时间 加热后，提取蛋白质并进行SDS-PAGE电泳，其条带在一定的分子量区间内与没有满足加热的样品中 提取的蛋白质的图谱有明显不同，不同表现在条带的多少和浓度上。 4.2乳酸脱氢酶活性测定方法 乳酸脱氢酶活性可以推算出禽畜肉是否达到相应加热温度。乳酸脱氢酶活性测定的原理为乳酸和氧化 型辅酶在乳酸脱氢酶的催化下生成还原型辅酶和丙酮酸，丙酮酸与2，4-二硝基苯耕反应生成丙酮酸二 硝基苯腺。反应中，乳酸脱氢酶催化乳酸生成丙酮酸，然后丙酮酸与试剂中的2，4-二硝基苯耕反应生 含量或活性，并与已被加热到规定温度的禽畜肉的标准酶活值进行比较，最终可判断样品是否达到适当 的加热温度。 5试剂 除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化纯试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。 5.1中等相对分子质量蛋白质标准的组成：RabbitphosphorylaseB974ooDalton、BovineSerumAl- bumin 66200 Dalton,Ovalbumin 42700Dalton,Carbonic Anhydrase 31000Dalton,Trypsin Inhibitor 20100Dalton、Lysozyme14400Dalton）开封后溶于200μL的双蒸水，分装于20个小管内（每管 10μL），于沸水中加热5min后，保存于一20℃。使用前于室温融化，加DTT至100mmol/L，于沸水 中加热5min后上样。如果用银染检测蛋日，应用1×的上样缓冲液（50mmol/LTris-HCl，pH6.8， 10%甘油，2%SDS，0.05%漠酚蓝，100mmol/LDTT）稀释50倍后再上样。 5.2A液100mL：29.2g丙烯酰胺，0.8gN,N-甲叉双丙烯酰胺，加去离子水定容至100mL。 5.3B液100mL：75mL2mol/LTris-HCl(pH8.8），4ml10/SDS,21mL加去离子水。 5.4C液100mL:50mL1mol/LTris-HCl(pH6.8),4mL10%SDS,46mL加去离子水。 5.55倍样品缓冲液:0.6mL1mol/LTris-HCl(pH=6.8)5mL50%甘油。2mL10%SDS 0.5mL2-巯基乙醇，1mL1%溴酚蓝，0.9mL去离子水。 5.610%SDS（十二烷基磺酸钠）。 5.710%过硫酸铵（AP）。 5.8 TEMED（四甲基乙二胺）。 5.9 染色固定液：取50%甲醇454mlL，冰乙酸46ml混匀。 5.10 染色液：称取考马斯亮蓝R2500.125g，加上述固定液250mL，过滤后备用。 5.11 脱色液：冰乙酸75mL，甲醇50mL，加蒸馏水定容至1000mL。 2