SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2055—2016 代替SN/T2055—2008 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Cowpea severe mosaic virus 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2055—2016 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T2055—2008《豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法》，与SN/T2055—2008相比，主要 变化如下： 增加了常规RT-PCR检测方法； 一增加了实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准负责起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人 民共和国厦门出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：李桂芬、孔君、李彬、马洁、陈青、魏梅生、张永江。 本标准所代替标准的历次发布情况为： -SN/T2055—2008。 行业标准信息服务平台 1 SN/T2055—2016 豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了植物检疫中豇豆重花叶病毒检疫鉴定方法。 本标准适用于豆科繁殖材料（种子、植株）中豇豆重花叶病毒的检疫鉴定。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3基本信息 学名：Cowpea severe mosaic virus 缩写：CPSMV 分类地位：伴生豇豆病毒科（Secoviridae），豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae），豇豆花叶病毒属 (Comovirus)。 该病毒的其他信息参见附录A。 4方法原理 根据豇豆重花叶病毒与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行ELISA检测：根据该病毒核酸的 序列进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定；根据该病毒核酸序列设计特异性引物和 荧光探针，通过检测的荧光信号进行结果判定。 5仪器设备及试剂 5.11 仪器设备 酶标仪、天平（感量，1/10000g）、pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、 凝胶成像系统、隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等。 微量移液器（2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、酶联板、研钵、离心管、花盆、消毒土等。 5.2试剂 酶联免疫吸附测定试剂见附录B的B.1、RT-PCR检测试剂见附录 C的 C.1、实时荧光RT-PCR检 测试剂见附录D的D.1。 试验用水应符合GB/T6682要求。 6样品制备 6.1种子 1 SN/T 2055—2016 号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定 和分子检测。 6.2植株 有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的植株编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法 和检测方法同6.1。 7检测方法 7.1酶联免疫吸附测定 见附录B。 7.2 2RT-PCR检测方法 见附录C。 7.3 实时荧光RT-PCR检测方法 见附录D。 7.4生 生物学测定 见附录E。 8结果判定 样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行： 先用DAS-ELISA方法进行检测。 若DAS-ELISA结果为阴性时,RT-PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带CPSMV；检测结果 为阳性，则对产物进行测序，测定的序列为CPSMV序列，则判定样品携带CPSMV；或用实时荧光RT- PCR进行检测，若检测结果为阴性，则判定样品不携带CPSMV；若检测结果为阳性，则判定样品携带 CPSMV. 若DAS-ELISA结果为阳性时，RT-PCR检测或实时荧光RT-PCR检测为阳性，即可判定待检样品 信息服务 携带CPSMV。 9样品保存与结果记录 9.1样品保存 经检测确定携带豇豆重花叶病毒的样品应在合适的条件下保存，种子在室温干燥保存1年；植株 一80℃保存1年，做好标记和登记工作。 9.2结果记录 完整的记录包括：样品的来源、时间、地点、方法和结果等并要有经手人和实验人员的签字。酶联测 定需有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光RT-PCR检测需要有反应 原始数据，生物学测定需有鉴别寄主的症状照片。 2