ICS 67.050 SN C 53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1943—2019 代替SN/T1943—2007 小麦及其制品中转基因成分普通 PCR和实时荧光PCR定性检测方法 Protocol of PCR and real-time P( CR for qualitative testing genetically modified wheat and its processed products 2019-10-25发布 2020-05-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T1943—2019 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1943一2007《小麦中转基因成分PCR和实时荧光PCR定性检测方法》。 本标准与SN/T1943一2007相比，主要技术变化如下： 将原标准中、英文名称进行了修订； 增加了方法标准的检测低限； 在适用范围上增加了小麦深加工产品的检测，增加了不适用产品检测范围； 一增加了转基因小麦品系内外源基因序列来源的有关信息和genebank序列号，增加必要的小麦 基因的核苷酸序列。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国哈尔滨海关、中华人民共和国上海海 张舒雅、甄珍。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1943—2007。 标准信息服务平台 SN/T 1943—2019 小麦及其制品中转基因成分普通 PCR和实时荧光PCR定性检测方法 1范围 本标准适用于转基因小麦品系B73-6-1、B72-8-11b、B102-1-2及其制品中转基因成分筛选检测。 本标准不适用于小麦胚油及小麦胚油为原料的深加工产品。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 X GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 GB/T27403实验室质量控制规范 食品分子生物学检验 3术语和定义 3.1 检测低限limit of detection,LOD 被检测物能被可靠检出的最低浓度或含量， 3.2 筛选检测screeningdetection 用几种转基因生物相同基因成分的检测方法（PCR扩增检测启动子、终止子或其他被关注的基因 成分等方法）对试样进行检测，确定是否存在有转基因成分的过程。 3.3 确证检测confirmatorydetection 当普通PCR检测结果为阳性时，使用另一种方法对试样进一步鉴定检测加以确证的过程。可使用 的方法有实时荧光PCR、特异DNA探针杂交、PCR产物限制性内切酶酶切分析、PCR产物序列测定等 方法。 4原理 针对转基因小麦基因组中含有的内源基因、外源基因的序列（其来源见附录A中表A，1）设计特异 的引物和探针，分别利用定性PCR和实时荧光PCR技术，对这些基因片段进行扩增，并根据实验结果， 1 SN/T 1943—2019 判断该样品的核酸中是否含有转基因成分。 5试剂与材料 试剂均为分析纯试剂或生化试剂，实验用水应符合GB/T6682中规定的一级水的要求。 5.1三氯甲烷。 5.2异戊醇。 5.3异丙醇。 5.4氯化镁。 5.5 5十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）。 5.7 乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA-Naz·2H,O)。 5.8 70%乙醇。 5.9 三氯甲烷-异戊醇溶液：按V（三氯甲烷）：V（异戊醇）=24：1配制。 5.10 10g/mLRNA酶溶液（RNaseA)。 5.11 10XPCR缓冲液（不含氯化镁）。 5.12 5.13 6×上样缓冲液（6XLoadingBuffer）。 5.14 Taq DNA 聚合酶。 5.15 尿嘧啶糖基化酶（UNG酶，UracilN-glycos 5.16 琼脂糖。 5.17 10mg/mL溴化乙锭溶液。 5.18 氯化钠。 5.19 氢氧化钠。 5.20 冰乙酸。 NA Marker)。 5.21 你准信 5.22 盐酸。 5.230.1mol/L盐酸溶液。 5.240.1mol/L氢氧化钠溶液。 5.25CTAB裂解液:称取4.00gCTAB、16.38gNaCl、2.42gTris、1.50gEDTA-Na2·2H,O.用适量 水溶解后，用0.1mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至8.0，定容至200mL，高压 灭菌。 5.26500mmol/LEDTA溶液（pH8.0）：在800mL水中加入186.1gEDTA-Na²2H2Q.在磁力搅 拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节pH至8.0（约需20gNaOH），然后定容至1L，高压灭菌。 5.271mol/LTris-HCl溶液（pH8.0）：称取121.1gTris，溶于800mL水中，搅拌，加人42mLHCl， 冷却至室温，用0.1mol/L盐酸溶液准确调节pH值至8.0，高压灭菌。 5.28TE缓冲液(pH8.0):量取10mL1mol/LTris-HCl溶液(pH8.0)和2mL500mmol/LEDTA 溶液，用0.1mol/L盐酸溶液或0.1mol/L氢氧化钠溶液（调节pH至8.0，用水定容至1000mL，高压 灭菌。 5.2950XTAE缓冲液：称取242gTris，加57.1mL冰乙酸、100mL500mmol/LEDTA溶液（pH 8.0），溶于蒸馏水中，定容至1L，高压灭菌，使用前稀释成1XTAE缓冲液。 却至55℃~60℃左右，加入10mg/mL溴化乙锭溶液约5μL至终浓度为0.5μg/mL左右，轻轻摇 2