SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1554—2016 代替SN/T1554—2005 鸡法氏囊病检疫技术规范 Quarantine protocol for chicken infectious bursal disease 行业标准信息服务平台 2016-12-12发布 2017-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1554—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1554一2005《鸡传染性法氏囊病酶联免疫吸附试验操作规程》，与SN/T1554- 2005相比，主要技术变化如下： 增加了鸡法氏囊病毒分离与鉴定； —一增加了直接免疫荧光试验； 一增加了反转录-聚合酶链式反应； 一增加了实时荧光反转录-聚合酶链式反应； 增加了琼脂凝胶免疫扩散试验。 本标准参照了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2008)第2.3.12章《传染性法氏囊病-甘波 罗病》。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院， 本标准主要起草人：孙洁、廖立珊、陶虹、刘建利、杨春华、杨俊兴、唐金明、林庆燕、曾少灵、张彩虹、 秦智锋、吕建强、花群义、曹琛福、宗卉、陈书琨、张强、阮周曦。 本标准所代替的标准的历次版本发布情况为： SN/T1554—2005。 行业标准信息服务平台 1 SN/T1554—2016 鸡法氏囊病检疫技术规范 1范围 本标准规定了鸡法氏囊病的临床症状与病理变化、病毒分离与鉴定、反转录-聚合酶链式反应、实时 荧光反转录-聚合酶链式反应、直接免疫荧光试验、琼脂凝胶免疫扩散试验、酶联免疫吸附试验。 本标准适用于进出境鸡法氏囊病I型的诊断和检疫 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB/T27634一2011传染性囊病病毒核酸检测方法 3诊断技术 3.1临床诊断 3.1.1临床症状 当出现以下部分或全部症状时，可作为初步诊断的依据之一：啄肛、腹泻，排出白色黏稠或水样稀 的羽毛被粪便污染，脱水严重，趾爪干燥，眼窝凹陷，衰竭死亡。其他参见附录A。 3.1.2病理变化 当出现以下肉眼可见的病变时，可作为初步诊断的依据之一：法氏囊肿大出血，严重出血呈紫黑色 如紫葡萄状，法氏囊水肿，囊壁增厚，外形变圆，呈土黄色，包裹有胶冻样透明渗出物；肌肉出血，大腿内 服务平 外侧和胸部肌肉常见条纹状或斑块状出血；腺胃和肌胃交界处出现出血点或出血斑；肾脏肿大，尿酸盐 沉积，输尿管扩张。 3.2病毒分离与鉴定 3.2.1样品的采集和处理 按照GB/T18088的要求进行样品的采集，所有用水需符合GB/T6682二级水、三级水要求。 出现临床症状的病死鸡，剖检后取法氏囊和脾脏，切碎，1：5（质量体积比）比例加入含抗生素的 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2)（配方见附录B研磨后反复冻融3次，4000r/min离心10min， 取上清液作为被检样本。 1 SN/T1554—2016 3.2.2雏鸡接种试验 3.2.2.1接种雏鸡 取上清液，点眼接种5只14d～21d无IBDV母源抗体维鸡或无特定病原体（SPF）鸡，每只鸡 0.05mL。同时用标准IBDV毒株（CJ801-BKF)作为阳性对照,PBS溶液作为阴性对照。接种3d～4d 后剖杀，检查法氏囊和脾脏病变。 3.2.2.2结果判定 阳性对照雏鸡剖检结果：雏鸡死亡，法氏囊水肿、色黄，严重可见出血。脾脏肿大，表面有灰色点状 病变。阴性对照剖检正常。在阳性对照和阴性对照都成立的情况下，对样品接种后的维鸡进行剖检。 阳性：剖检可见阳性对照特征性病变。 阴性：剖检显示正常。 对于结果判定为初步阳性的样品，进行下一步试验进行确证。 3.2.3鸡胚接种试验 3.2.3.1接种鸡胚 取上清液经0.22μm滤膜过滤除菌后，经卵黄囊接种5枚6d~8d无IBDV母源抗体鸡胚或SPF 鸡胚，同时经绒毛尿囊膜接种5枚9d～11d无IBDV母源抗体鸡胚或SPF鸡胚，每只0.2mL，接种后 用石蜡封住接种孔。同时用标准IBDV毒株（CJ801-BKF）作为阳性对照，PBS溶液作为阴性对照进行 鸡胚病毒接种试验。37℃土1℃孵育，每天照蛋检查，弃去48h内死亡的鸡胚。 3.2.3.2结果判定 阳性对照鸡胚剖检结果：标准的IBDV毒株（CJ801-BKF）接种鸡胚3d～5d后剖检鸡胚矮小，充 血，羽毛囊、趾关节和大脑有出血斑。肝脏可见坏死，色淡似熟肉样。阴性对照剖检结果：剖检正常。在 阳性对照和阴性对照都成立的情况下，对样品接种后的鸡胚进行剖检 阳性：接种后3d~6d后，鸡胚剖检有阳性对照特征性病变。 阴性：接种后5d～6d，鸡胚存活，剖检正常。 结果判定为初步阳性的样品收集病料，除去头和四肢，研磨匀浆，制备病料悬液，进行下一步试验 进行确证。 3.3反转录-聚合酶链式反应 按照GB/T27634—2011的要求进行RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测病毒核酸。 3.4直接免疫荧光试验 3.4.1材料及方法 3.4.1.1特异性单克隆抗体 特异性抗IBDV单克隆抗体由指定单位提供，琼脂凝胶免疫扩散试验效价为1：128以上 3.4.1.2直接荧光抗体的制备 录B)调整抗体浓度至10mg/mL。取5mL抗体溶液，称取1mg异硫氰酸荧光素溶于0.2mL二甲基 2