SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1460—2015 代替SN/T1460—2004 输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎 病毒的检测方法 Detection methods for west nile virus and St.Louis encephalitis virus carried by importedmosquitoes 行业标准信息服务平台 2015-09-02发布 2016-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1460—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1460一2004《输人性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒的检测方法》。 本标准与SN/T1460—2004相比，主要变化如下： 增加了规范性引用文件； 室设计原则、病毒核酸分子检测操作要求、实验室设施和设备，检测工作的安全防护和实验室 废弃物处理的要求； 对病毒核酸分子检测方法进行了修订，增加了实时荧光RT-PCR方法； 删除了附录A。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：郑剑宁、胡群、李红、裘炯良 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1460—2004。 行业标准信息服务平台 1 SN/T1460—2015 输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎 病毒的检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸输入性蚊类携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒检测的生物安全要求、检测 对象、检测方法、结果的报告。 本标准适用于检验检疫机构对输入性蚊类体内携带西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒检测和报告，对 口岸发现的蚊类检测西尼罗病毒与圣路易脑炎病毒也可参照执行。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 输入性蚊类inported mosquitoes 通过人境交通工具、集装箱、货物及行李带入境内的库蚊、伊蚊属蚊类。 3.2 西尼罗病毒 westnilevirus;WNV 西尼罗热的病原体，属黄病毒科黄病毒属，为单链RNA病毒。西尼罗病毒分两个基因型，导致人 类感染西尼罗病毒的分离株主要为I型。主要分布于非洲中东、西亚和北美。 3.3 圣路易脑炎病毒 St.Luis encephalitis virus;SLEV 圣路易脑炎的病原体，属黄病毒科黄病毒属，为单链RNA病毒。主要分布于北美洲。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：循环值（cyclethreshold) DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） FAM:6-羧基-荧光素（6-carboxy-fluorescein） 1 SN/T 1460—2015 RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction) TAMRA：四甲基罗丹明（tramethylrhodamine) 5检测对象 输入性蚊类。 6生物安全要求 实验室及检验应遵照以下生物安全要求： a）生物安全实验室设计原则应遵照GB19489的规定。 b) 实验室设施和设备应遵照GB19489规定的BSL-2实验室要求。 c) 实验室废弃物处理应遵照GB19489对废物处置的要求。 d) 检测工作的安全防护应遵照WS233型规定的二级生物安全个体防护要求。 e) 病毒核酸分子检测检测操作要求应遵照相关国家标准的规定。 7 病毒核酸分子检测——普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法 7.1 仪器和设备 需要如下仪器设备： a) 荧光定量PCR仪； b) PCR 仪; c) 二级生物安全柜； d) 普通冰箱； e) 一70℃超低温冰箱； f) 普通台式离心机； g) 高速冷冻离心机（离心力可达12000g）； h) i) 涡旋器； j) 电泳仪； k) 凝胶成像分析系统； 1) 高压灭菌锅。 7.2 主要试剂 7.2.1 除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯 7.2.2实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。用于PCR（包括核酸抽提）时所用的水应是无 RNA酶的水。 7.2.3核酸提取试剂为Trizol总RNA提取试剂或商品化的病毒RNA提取试剂盒。 7.2.4、引物和探针为根据表1和表2的序列进行合成引物和探针，加无RNA酶的超纯水配制成 20 μmol/L的储存液。 2