SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1135.8—2017 代替SN/T1135.8—2009 马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Phoma foveata Foister 行业标准信息服务平台 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1135.8—2017 前言 SN/T1135共分为13部分； 第1部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法； 第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法； 第3部分：马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法； 一第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法； 第5部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法； 第6部分：马铃薯排腐病菌检疫鉴定方法； 第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法； 第8部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法； 第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法； 第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法； 第11部分：马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法； 第12部分：马铃薯M病毒检疫鉴定方法； 第13部分：马铃薯Y病毒检疫鉴定方法。 本部分为SN/T1135的第8部分。 本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本部分代替SN/T1135.8一2009《马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法》。 本部分与SN/T1135.8一2009相比，主要技术差异如下： 将生物学特性中培养性状与孢子形态进行了补充，增加了分子生物学检测方法。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国甘肃出入境检验检疫 局、甘肃省农业科学院植物保护研究所。 本部分主要起草人：李鑫、文朝慧、黑多尔、何苏琴、刘伟、王秀芬、王有福。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： 准信息服务平台 SN/T1135.8—2009。 I SN/T 1135.8—2017 马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法 1范围 SN/T1135的本部分规定了马铃薯坏疽病菌的检疫鉴定方法。 本部分适用于所有进境马铃薯薯块携带的马铃薯坏疽病菌的检疫鉴定。 2基本信息 中文名：马铃薯坏疽病菌 英文名:potato gangrene,gangrene of potato,tuber rot,tuber gangrene,dry rot of potato,leaf spot of tobacco,leaf spot of bean 有性态：Boeremiafoveata（Foister)Aveskamp，Gruyter&Verkley 无性态：PhomafoveataFoister 异名：Phomaeriguavar.foveata（Foister)Boerema Phoma solanicola var.foveata(Foister)Malc. Phoma solanicola f. foveata (Foister)Malc. 分类地位：真菌界（KingdomFungi)，子囊菌门Ascomycota，座囊菌纲Dothideomycetes，格孢腔菌 目Pleosporales，Didymellaceae科，Boeremia属。 传播途径：受侵染的马铃薯种薯的调运是远距离传播蔓延的主要途径。昆虫和线虫有利于病原菌 局部传播。 马铃薯坏疽病菌的其他信息参见附录A。 3方法原理 本部分以该病菌在马铃薯上的主要危害症状特征、病原菌培养特性、形态特征及特异性PCR反应 信息服务平 为鉴定马铃薯坏疽病菌的依据。 4仪器设备和主要试剂 4.11 仪器设备 电子天平（感量1/10000g）、解剖镜、显微镜、超净工作台、温控培养箱、高压灭菌锅、低温冰箱、普 通冰箱、镊子、量筒、培养血、移液器、水平凝胶电泳装置、PCR仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机等。 4.2主要试剂和培养基 TaqDNA聚合酶、DL2000、dNTP、10XPCR缓冲液、无水乙醇、次氯酸钠、氨水、马铃薯琼脂培养 基（PDA）、燕麦培养基（OA）、麦芽糖琼脂培养基（MEA）（培养基配方参见附录B） 1 SN/T 1135.8—2017 5病原菌鉴定 5.1症状检查 观察马铃薯薯块是否有病斑及菌丝、分生孢子器等，如有病斑，将其刨开。马铃薯坏疽病菌在马铃 薯块茎上的症状为暗色凹陷病斑。病斑易皱缩或剥离，内部常形成干的空腔。干空腔常扩展，产生带有 灰色或暗褐色到紫色的菌丝，并产生分生孢子器。（参见附录A） 小茎点霉变种（P.eriguavar.eigua）在马铃薯薯块上可产生与马铃薯坏疽病菌相同的症状，该菌 为弱寄生菌，可以用培养特征进行区别。 由Fusariumspp.引起的干腐病通常产生比较平整的同心轮纹病斑，病斑表面经常可见白色、粉白 色或蓝紫色的真菌垫。 5.2直接镜检 挑取疑似样品病斑部位的菌丝或分生孢子器，用移植环移于载玻片中央的水滴中，在显微镜下观 察，拍照记录。 5.3病菌的分离、纯化及形态观察 取有马铃薯坏疽病可疑症状的薯块，切开并在其病健交界处取样，切成小块，0.5%的次氯酸钠表面 消毒5min，无菌水冲洗3遍，置于PDA平板上，每血放置5块6块；或在无菌状态下直接挑取菌丝置 现分生抱子器。 在PDA平板上，20℃培养7d，菌落直径（69.7土0.5）mm，菌落灰褐色，边缘白色，菌落背面黄褐 色；培养20d，菌落红褐色，表层的网状菌丝上散生大量黑色微粒状分生孢子器，菌落表面散布无色透明 微小水珠，菌落背面可见大小不等的黑褐色斑块， 在0A培养基上，20℃培养7d，菌落直径（72.2士0.6）mm，菌落黄褐色，边缘整齐，几乎没有气生 菌丝，菌落背面黄褐色，培养14d，菌落深豆沙色，气生菌丝薄而稀疏，边缘稍多：培养基内生大量深褐色 斑块，菌落背面与正面色同。 在MEA培养基上，20℃培养7d.菌落直径（70.7士1.2)mm，菌落淡黄褐色，边缘整齐，气生菌丝薄 毡状，菌落背面亮黄褐色；培养14d，菌落黄褐色，气生菌丝薄毡状，菌落表面散生暗褐色分生孢子器，菌 落背面亮黄褐色，可见黄色粉粒状结晶。 马铃薯坏疽病菌的分生孢子器褐色，球形、扁圆形，散生或多个聚集，具孔口，内生大量分生孢子，遇 水或挤压后分生抱子从孔口涌出，分生孢子短柱状、长椭圆形或卵圆形，单胞、无色，偶双胞，有的两端各 具2个油球，在PDA培养基上分生孢子大小为（4.7μm~9.2μm）×（2.5um4.4μm），分生孢子器大 小约为（82um～210μm）×（64μm～175μm），厚垣孢子球形或近球形，多串生，大小为（27μm~ 81μm）X（18μm63μm）（参见附录B）。 5.4生化特征 暗条件下培养7d，测量菌落直径，描述菌落形态；然后在20℃下进行13h近紫外灯+11h黑暗/d，培 养7d，以刺激菌落色素的产生，并在菌落边缘滴加1mol/LNaOH水溶液，观察色斑反应。 NaOH斑反应显示出特有的紫红色，表明有可扩散的葱醌色素产生（参见附录B）。 2