SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4053—2014 鸡传染性贫血检疫技术规范 Quarantine protocol for chicken infectious anemia 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4053—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国东莞出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：沙才华、杨素、陈轩、许彩芸、梁玉英、王岚、陈进会、徐海聂、罗宝正、廖秀云。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4053—2014 鸡传染性贫血检疫技术规范 1范围 本标准规定了鸡传染性贫血（CIA)病毒分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）、荧光聚合酶链式反应 （荧光PCR）、间接免疫荧光（IFA)以及酶联免疫吸附试验（ELISA)的技术要求 本标准适用于鸡传染性贫血的检疫。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 病毒分离与鉴定 3.1试剂 3.1.1改良最低要素营养液（DMEM)培养基，配制方法见A.1。 3.1.2马立克氏病病毒转化的淋巴细胞系MDCC-MSB1细胞。 3.1.3标准阳性血清：用CIAV抗原免疫SPF鸡获得的血清。 3.1.4 标准阴性血清：无CIAV感染的SPF鸡血清 3.1.5 新生牛血清、青霉素、链霉素 业标准信息服务平台 3.2 仪器与器材 3.2.1 二氧化碳培养箱。 3.2.2 水浴锅。 3.2.3 普通冰箱及低温冰箱。 3.2.4离心机。 3.2.5倒置显微镜。 3.2.6微量移液器，容量2μL~20μL，20μL~200μL。 3.2.7 细胞培养瓶、吸管、离心管、研磨器械、0.2um微孔滤膜。 3.3样品的采集及处理 CIAV存在于病鸡肝脏、皮肤、脾脏、胸腺、法氏囊、肾脏和骨髓等组织器官中。无菌采集上述组织， 用无血清DMEM制成20%组织悬液，3000r/min离心30min，取上清于70℃处理5min后，加等量 10%三氯甲烷室温处理15min，10000r/min离心20min，取上清用于CIAV病毒分离。 1 SN/T 4053—2014 3.4操作方法 3.4.1 细胞培养 用含15%新生牛血清的DMEM培养基在39℃和5%二氧化碳环境下培养MDCC-MSB1细胞。 每2d3d传代一次，待细胞长至2X105个/mL~5X105个/mL时，用于CIAV病毒分离。 3.4.2病料接种 将0.1mL处理好的组织悬液接种MDCC-MSB1细胞，在39℃和5%二氧化碳环境下培养48h，观 察结果。 3.4.3结果观察 CIAV感染细胞后，细胞体积增大，随后溶解。若第一次接种未出现细胞病变，将细胞培养物冻融 后盲传三代。如仍无细胞病变，则判为CIAV阴性。 3.5 5CIAV的鉴定 出现细胞病变的细胞培养物，用PCR和荧光PCR方法进行鉴定 4聚合酶链式反应(PCR)1) 4.1试剂 4.1.1 除特别说明以外，本标准所用水应符合GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法的要求，所 用试剂均为分析纯。 4.1.2 DNA提取液（配制方法参见附录B)。 4.1.3 三氯甲烷（常温保存）。 4.1.4 异丙醇（使用前预冷至一20℃）。 4.1.5 75%乙醇，采用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，使用前预冷至一20℃。 4.1.6 0.01mol/LPBS.pH7.2(配方见A.2)。 4.1.7 TE缓冲液（配制方法见A.3）。 4.1.8电泳缓冲液（配制方法见A.4）。 4.1.9 溴化乙锭溶液（10mg/mL）。 4.1.10 CIAVCUX-1标准株DNA,10XPCR缓冲液，25mmol/L的MgCl2，10mmol/L的dNTPs， 5U/μL的TaqDNA聚合酶。 4.1.11选择CIAV特异性VP1基因序列作为CIAV检测的靶序列，产物长度582bp，上游引物和下游 引物序列如下： 上游引物：5'-AATGAACGCTCTCCAAGAAG-3' 下游引物：5'-AGCGGATAGTCATAGTAGAT-3' 4.2仪器与器材 4.2.1PCR仪。 4.2.2紫外成像仪 1) 同类的商品化试剂盒适用。 2