SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1558—2017 代替SN/T1558—2005 禽脑脊髓炎检疫技术规范 Quarantine protocol for avain encephalomyelitis 行业标准信息服务平台 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1558—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1558一2005《禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验操作规程》。 本标准与SN/T1558一2005相比，主要技术变化如下： 增加了禽脑脊髓炎病毒分离； 一增加了反转录-聚合酶链式反应； 一增加了间接免疫荧光试验； 一增加了酶联免疫吸附试验。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院 本标准主要起草人：杨俊兴、孙洁、廖立珊、张彩虹、刘建利、陶虹、林彦星、吕建强、曹琛福、卢体康 花群义、秦智锋。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -SN/T1558—2005。 行业标准信息服务平台 1 SN/T1558—2017 禽脑脊髓炎检疫技术规范 1范围 本标准规定了禽脑脊髓炎的病毒分离与鉴定、反转录-聚合酶链式反应、间接免疫荧光试验、酶联免 疫吸附试验、琼脂扩散试验的检测技术。 本标准适用于禽脑脊髓炎的检疫。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AE：禽脑脊髓炎（参见附录A）（Avianencephalomyelitis） AEV：禽脑脊髓炎病毒（Avianencephalomyelitisvirus) AGID：琼脂扩散试验（Agargel immunodiffusiontest) BSA：牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin) CEF：鸡胚成纤维细胞（Chickenembryofibroblast) ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay) PBS:磷酸缓冲液（Phosphatebuffersaline) RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-Polymerasechain reaction） 标准信： 4病毒分离与鉴定 4.1设备、器材和试剂 组织研磨器、注射器等。 4.1.2材料：SPF种蛋、SPF维鸡 4.1.3主要试剂：生理盐水、青霉素（10000IU/mL)、链霉素（10000 μg/mL）。7) 4.2样品的采集、保存和运输 存和运送按SN/T2123进行操作。 4.3 3样品的处理 将组织样品无菌称量、研磨，反复冻融3次，用无菌生理盐水溶液作1：5（W/V）稀释制成悬液，并 1 SN/T 1558—2017 加青霉素（终浓度为100IU/mL）和链霉素（100μg/mL）。样品经4000r/min离心10min，取上清液， 冻存、备用。 4.4鸡胚接种 取4.3中上清液，以0.2mL/胚，经卵黄囊无菌接种6日龄SPF鸡胚，每份样本至少接种5枚鸡胚， 同时设未接种病料的空白对照组和接种0.2mLSPF鸡脑组织处理液的阴性对照组。于37℃孵化箱 内孵育至16日龄。每隔12h观察鸡胚死亡情况，并记录。收集24h后死亡和仍存活的鸡胚，无菌吸取 胚液（尿囊液和羊水），然后观察胚体发育情况；检查胚体、胚脑病变。若鸡胚有病变或鸡胚死亡，取胚 脑、胃、肠、胰腺称量、研磨，以胚液作1：5稀释，加入青霉素（终浓度为100IU/mL）和链霉素（100μg/ mL），4000r/min离心10min，制成鸡胚组织病毒液，即为第1代病毒液（AEVE1）。取AEVE1按照 本条上述方法再接种6日龄SPF鸡胚卵黄囊，传代2代，收集胚液，即可作为病毒鉴定用的病毒液。若 鸡胚无病变，盲传至第5代。与健康对照组鸡胚相比，发病鸡胚病变为：胚体活力减弱、发育不良和肌肉 萎缩（胚体重减轻）、腿细、爪曲或强直，脑萎缩，皮下、脑、胃肠水肿、出血等。 可进一步通过RT-PCR和/或间接免疫荧光试验进行病毒鉴定（见第5章、第6章）。 5反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR) 5.1设备、器材和试剂 5.1.1主要设备和器材：PCR仪、离心机、电流仪、电泳槽、凝胶成像系统、一20℃冰箱。 5.1.2主要试剂：Trizol、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、PCR反应缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP、琼 脂糖,DNAmarker。 注：核酸提取可使用等效的商品化病毒核酸提取试剂盒 5.1.3对照样品：灭活AEV作为阳性对照，由指定单位提供。SPF鸡胚尿囊液作为阴性对照。 5.2 引物和序列 P1:5'-CTTATGCTGGCCCTGATCGT-3; P2:5'-CCACAAACCTAGCCAAGGTG-3'; 扩增目的片段为612bp。 5.3核酸提取 5.3.1取250μL处理后的样品置于1.5mL离心管中，作好标记。同时设立阳性样品、阴性样品对照。 加人3倍体积的Trizol，震荡混合20s，静置5min。 5.3.2加人200μL三氯甲烷，震荡混合20s，静置5min；4℃12000r/min离心15min，取上清液置 另一个标记好的1.5mL离心管中，加人等体积异丙醇，一20℃静置15min 5.3.34℃12000r/min离心15min，弃去上清，加人1mL75%乙醇。 5.3.44℃12000r/min离心15min，小心弃去乙醇，将离心管倒置于滤纸上，自然晾干，加人20μL DEPC水溶解沉淀，即为RNA模板，可立即用于RT-PCR检测，或放一20℃保存。 5.4 RT-PCR检测 5.4.1反应体系 10XRT-PCR缓冲液 2.5μL P1(20 μmol/L) 1 μL 2