SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1247—2007 代替SN/T1247.1~1247.2—2003 猪繁殖和呼吸综合征检疫规范 Quarantine protocol for porcine reproductive and respiratory syndrome 行业标准信息服务平台 2007-08-06发布 2008-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1247—2007 前 言 本标准代替SN/T1247.1—2003《猪繁殖和呼吸综合征间接免疫荧光试验》和SN/T1247.2—2003 《猪繁殖和呼吸综合征免疫过氯化物酶单层试验》。 本标准的附录A、附录B、附录C和附录D是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫 局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：孙颖杰、张伯强、白泉阳、苏永生、简中友、袁文泽、赵祥平、董志珍。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1247.1—2003; —SN/T1247.2—2003。 行业标准信息服务平台 I SN/T 1247—2007 猪繁殖和呼吸综合征检疫规范 1范围 本标准规定了猪繁殖和呼吸综合征（PRRS)的检疫规范。 本标准适用于猪繁殖和呼吸综合征的病毒分离鉴定、病毒抗原监测、病毒抗体检测，可用于该病的 检疫、诊断和流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， GB/T18090—2000猪繁殖和呼吸综合症诊断方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 免疫过氧化物酶单层试验immunoperoxidasemonolayerassay（IPMA） 培养的单层细胞，接种PRRS病毒或处理过的被检样品，让30%～50%细胞感染，经组织固定和内 源酶处理，加被检血清或阳性抗体处理，再加酶标抗抗体，经过显色反应检测抗原或抗体的存在。在 PRRS诊断上最早用于检测其抗体。 3.2 间接免疫荧光试验indirectfluorescentantibodytest（IFA） 成切片或涂片的标本经过固定后，加抗血清处理，再加荧光标记的抗抗体染色，漂洗，滴加缓冲甘油 后用盖玻片封载，用荧光显微镜进行检测。检测抗体，可用于早期诊断。 4疾病概述 猪繁殖和呼吸综合征（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS），也称为蓝耳病 （Blue-earedDisease），是由猪繁殖和呼吸综合征病毒（porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的以母猪繁殖障碍和仔猪及育成猪呼吸困难为特征的接触性传染病。繁殖障碍的 特征是流产、死胎和产弱仔，弱仔由于呼吸道疫病和继发感染常常很快死亡；呼吸道特征是仔猪及育成 猪呼吸困难，年龄较大的猪可能出现温和性呼吸道症状，有时因继发感染而使病情复杂。其病原、流行 病学、诊断以及检疫与诊断参见附录A。 5检疫方法 5.1病毒的分离与鉴定（见GB/T18090一2000） 5.1.1设备、材料和试剂 5.1.1.1器材：96孔或48孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳恒温箱、普通冰箱及低温 冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径0.2um的微孔滤膜、普通光学显微镜。 5.1.1.2试剂：RPMI1640培养液、特牛血清、青霉素（10IU/mL）与链毒素（10μg/mL）溶液、7.5% 碳酸氢钠溶液等。 1 SN/T 1247—2007 5.1.1.3细胞：猪原代肺泡巨噬细胞培养物（PAM)或MARC-145或HS2H细胞。PAM由无PRRS 猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法参见附录C。MARC-145或HS2H细胞由国家指定单位 提供。 5.1.2样品的采取和送检 在发病早期，无菌采取病猪的血清或腹水。对病死猪（如流产的死胎）和扑杀猪（如弱胎猪），应立即 采取肺、扁桃体和脾等组织，置4℃保存，立即送实验室检疫。不能立即送检者，应置一30℃～一25℃冰 箱中，或加50%甘油生理盐水，4℃保存送检。 5.1.3样品的处理 后研磨成糊状，加人RPMI1640培养液，制成10%悬液，3000×g离心15min，吸取上清液，加人青霉 素500IU/mL、链霉素500μg/mL、庆大霉素500μg/mL和两性霉素B200μg/mL。怀疑有细菌污染的 样品，可用0.2um微孔滤膜过滤处理。 5.1.4操作方法 5.1.4.1稀释样品 100μg/mL、两性霉素B10μg/mL、pH7.2)90μL，在A1和C1孔内加人同一份已处理的样品各10μL （样品10倍稀释）。将板轻轻摇动后，从A1和C1排孔各取10uL分别移入B1和D1排孔内（样品100 倍稀释）。除第6列和第12列留作正常细胞对照外，其他各孔的样品稀释方法同上。振动稀释板后加 盖，置4℃冰箱内保存备用。 5.1.4.2制备细胞板 已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离物特别是欧洲型病毒株的良好生长，因此病毒分离应 首选PAM细胞，先将PAM细胞泥用细胞培养液RPMI1640稀释，使细胞终浓度为1X106个/mL，或 将MARC-145或HS2H细胞用营养液稀释，细胞终浓度5X10*个/mL。然后，在另一换96孔细胞培 养板上每孔加入上述细胞悬液100uL，于37℃5%二氧化碳恒温培养至形成单层细胞。 按照上述操作，每板可检测20份样品，每份样品重复两个滴度。第6列和第12列留作正常细胞对 照（不接种样品）。 5.1.4.3接种样品 由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液50uL，接种于已形成细胞单层的细胞板相应的孔内（第 一代）。细胞板加盖后，放入37C5%二氧化碳保湿恒温箱中培养，每天观察致细胞病变作用（CPE），连 续观察2d～5d。CPE通常在接种后1d～4d内出现，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱落 5.1.4.4培养物盲传 根据第一代培养物CPE出现的情况（通常在接种后的第2d～3d）安排盲传。盲传时，不论CPE 有无，一律各取孔内混悬液25uL，移人新细胞板相应的孔内。再于37℃5%二氧化碳恒温箱培养 2d5d，每天观察CPE。 5.1.5结果的判断和解释 在第二代培养结束时，不论是否出现CPE，对所有的孔应采用免疫过氧化物酶单层试验（IPMA）或 间接免疫荧光试验（IFA)进行终判；其结果呈现阳性反应的，则被认定为PRRS病毒分离阳性。 5.2免疫过氧化物酶单层试验（IPMA)（见GB/T18090） 5.2.1材料准备 5.2.1.1器材：微量移液器、倒置显微镜等。 5.2.1.2试剂：IPMA诊断板的制备参见附录C;标准阳性血清、标准阴性血清和免抗猪过氧化物酶结 合物均由国家指定单位提供，使用前按说明书规定稀释至工作浓度洗涤液、血清稀释液和显色/底物溶 液参照附录B自行配制。 2