SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1201—2014 代替SN/T1201—2003 饲料中转基因植物成分PCR 检测方法 PCR protocol for detection of genetically modified plant ingredients in feed 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1201—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1201一2003《植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法》。 本标准与SN/T1201一2003相比，主要技术变化如下： 增加了植物的品种，由原标准的大豆、玉米和油菜扩展到水稻、首、棉花和小麦等； 一增加了基因特异性筛查的范围，由原标准的6个外源基因扩展到12个外源基因； 增加了转基因品系鉴定的种类，由原标准的1个品系（抗农达转基因大豆RRS）增加到56个 品系； 原标准采用普通PCR方法，本标准全部采用实时荧光PCR方法，方法更灵敏，检测更快速。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：章桂明、凌杏园、潘广、向才玉、程颖慧、康林、余道坚、龙海、郑耘、陈枝楠。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1201—2003。 行业标准信息服务平台 1 SN/T1201—2014 饲料中转基因植物成分PCR 检测方法 1范围 本标准规定了饲料中转基因植物成分的定性实时荧光PCR检测方法。 本标准适用于饲料中大豆、玉米、水稻、油菜、棉花、首和小麦等转基因植物成分的定性检测和相 关品系的鉴定。 本标准同样适用于玉米酒糟转基因成分的定性检测和相关品系的鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测 实验室技术要求 GB/T19495.7转基因产品检测 抽样和制样方法 3术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 饲料feed 所有人饲养的动物的食物的总称，比较狭义的一般饲料主要指农业或牧业饲养的动物的食物。 3.1.2 实时荧光PCRreal-timefluorescentpolymerase chainreaction 在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，荧光信号的 服务平台 强弱直接反映模板数量。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Acpl：酸性磷酸酶1基因（acidphosphatase1) BAR：磷化麦黄酮乙酰转移酶基因（phosphinothricinacetyltransferasegene) BnACCg8：油菜乙酰辅酶A羧化酶基因（acetyl-CoAcarboxylasegene） bp：碱基对（basepair) Btc：转基因水稻品系TT51-1和Bt汕优63结构特异性基因序列（theconstructspecificDNAse quence of transgenic rice TT51-1 and Bt shanyou 63) 1 SN/T 1201—2014 CaMV35S：来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子（35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus） CP4-EPSPS：5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthasegene） CryIA（b）：苏云金芽孢杆菌结晶蛋白（cry）I型毒素抗虫基因［a syntheticgeneencodedthefirst 648 amino acids, insecticidal-active truncated product identical to that of cryIA (b) gene of Bacillus thuringiensis subsp, Kurstaki steain HD-1J CrylA（c）：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA（c）基因［asyntheticgeneencodedthe29to613 amino acids, insecticidal-active truncated product identical to that of cryIA(c) gene of Bacillus thuringiensis CrylA（b）/CrylA（c）：苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白crylA（b）和cryA（c）融合基因 Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数（cyclethreshold） CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（cetyltrithylammoniumbromide） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate) dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate) dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid) FMV35S：玄参花叶病毒的35S启动子（35Spromoterfromamodifiedfigwortmosaicvirus） Gos9：一种水稻根部表达蛋白基因 GOX：草甘磷氧化还原酶基因（glyphosateoxidoreductasegene） GUS：β-D-葡萄糖醛酸酶基因（beta-D-glucuronidasegene） NOS：胭脂碱合酶基因终止子（terminatorofnopalinesynthasegene） NPTIl：新霉素-3'-磷酸转移酶基因（neomycin-3'-phosphotransferasegene） PAT：来源于杆菌Bacillusamyloliquefaciens草丁磷乙转移酶基因（phosphinothricinacetyl- transferasegenefromBacillusamyloliquefaciens) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） PE3-PEPcase：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate-carboxylase） PLD:磷脂酶D基因(phospholipdase D) Taq酶：源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶 TE:Tris-HCI、EDTA缓冲液 TM:熔解温度（meltingtemperature） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷［tris（hydroxymethyl）aminomethane 服务平台 UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG）酶（uracil-N-glycosylase） Wx012：小麦蜡质基因 Zein：玉米醇溶性蛋白基因 zSSIb：玉米淀粉合酶异构体zSTSII-2基因 4原理 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 PCR扩增时在加人一对引物的同时加人一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别 标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基因发射的荧光信号被淬灭基团吸收； 2